【文章內(nèi)容簡介】 斷。設(shè)計試驗時，應(yīng)注意制劑的生產(chǎn)工藝，如有的藥材雖然含有揮發(fā)油，但是如果采用的水煮工藝，則揮發(fā)油基本上提取不出來，這就不宜再對成品中該藥材的揮發(fā)油進(jìn)行鑒別。如以出峰的相對保留時間作為鑒別特征時，必須提供氣相色譜中的該峰的特征參數(shù)，確證無誤，方可成立。 高效液相色譜很少直接用于中藥制劑的鑒別，如果含量測定采用了高效液相色譜法，則可在含量測定項目的進(jìn)行中考察可否間接地用于定性鑒別。尤其在用其他鑒別手段均無效時，可以考慮采用。設(shè)計試驗時也同樣要注意色譜條件的優(yōu)化和方法學(xué)驗證。 附：薄層色譜規(guī)范化的基本技術(shù)要求 由于中藥材及中藥制劑的鑒別采用薄層色譜法比較普遍，為了提高試驗的重現(xiàn)性及分離度，下列的技術(shù)要求可作為設(shè)計和進(jìn)行薄層色譜試驗時的參考。 薄層色譜的規(guī)范化技術(shù)要求 ①儀器與材料 A 薄層板 可用手工自制板或預(yù)制板，用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔，平整，最好使用厚度為l2mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層極，玻璃板需用洗液或堿液洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用；反復(fù)使用時應(yīng)注意需再用洗液或堿液清洗，如選用預(yù)制板應(yīng)注意生產(chǎn)廠家提供的有關(guān)參數(shù)，挑選，檢查并試用是否符合要求。 最常用的吸附劑通常是加有石膏作粘合劑的商品硅膠G，或加有熒光劑的硅膠GF254，有的另加其他粘合劑如羧甲基纖維素鈉以加固薄層板面；為了達(dá)到更好的分離的品種要求使用加有酸（如硼酸），堿（加氫氧化鈉）或緩沖溶液等薄層板。不同生產(chǎn)廠家或不同批次的商品硅膠質(zhì)量不可能完全相同，常常會影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性，在重復(fù)實驗時尤須注意、硅膠G因長期貯放可能使粘合力降低，薄層厚度一般為250～300μm，有的品種也使用纖維素板、氧化鋁板或聚酰胺板。 B 涂布器 應(yīng)能使吸附劑在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。商品有手工、半自動及自動薄層板涂布器。涂布的厚度有固定厚度（如250μm）或可以調(diào)節(jié)的兩種。 C 點(diǎn)樣器材： 最常用也最方便的是定量點(diǎn)樣毛細(xì)管（微升毛細(xì)管），、。對點(diǎn)樣用的微升毛細(xì)管的要求是標(biāo)示容量準(zhǔn)確，管端平整光滑，管壁潔凈，液流通暢，無堵塞，無污染，商品最常用的是Drummond Scientific Co．（美國）的產(chǎn)品，也可選用色譜用微量注射器（應(yīng)選用針尖平頭適合薄層點(diǎn)樣的）。 為了提高點(diǎn)樣效率，還可選用點(diǎn)樣輔助設(shè)備，如點(diǎn)樣支架，半自動或自動點(diǎn)樣器。選用點(diǎn)樣器材和輔助設(shè)備應(yīng)注意器材本身的質(zhì)量。 D 展開箱（層析缸） 應(yīng)當(dāng)用薄層色譜專用的展開箱，有平底展開箱和雙槽展開箱，還有一種水平式展開箱。雙槽展開箱具有節(jié)約溶劑、減少污染、便于預(yù)平衡及控制展開條件等優(yōu)點(diǎn)。水平式展開箱可以從薄層板的兩側(cè)向中間展開，展距5cm（特別是高效薄層板），所以一塊薄層板所承受的樣品個數(shù)比常規(guī)上行法展開增加了一倍。 用不合格的玻璃器皿如生物標(biāo)本缸等不能保證展開的質(zhì)量。 E 顯色與檢測儀器 薄層極展開后，有的需用試劑（顯色劑）顯色。涂布顯色劑有噴霧法和浸漬法。噴霧瓶應(yīng)能在一定壓力下使試劑噴成均勻的細(xì)霧狀。薄層掃描定量測定，顯色劑可控制噴灑的數(shù)量和噴霧的壓力。浸漬法用浸漬槽為特制的浸漬槽，將展開后的薄層板平穩(wěn)放入有顯色劑的浸漬槽中數(shù)十秒至1分鐘后取出（指凈薄層板背后的殘存試劑）顯色。浸漬槽可用適當(dāng)?shù)牟Ａ髅蟠妗?紫外光燈有長波段（365nm）和短波段（254nm）紫外光管，前者用于觀察具有熒光的色譜，后者一般用于觀察硅膠GFS254板色譜在薄層板面的熒光背景下出現(xiàn)的暗藍(lán)紫色吸收斑點(diǎn)，選用紫外光燈應(yīng)注意熒光管的功率和濾光片的性能。 薄層掃描儀不僅可以進(jìn)行原位定量，薄層掃描全圖譜對定性鑒別也能提供有用的信息。 ②操作方法 A 薄層板的制備 除另有規(guī)定外，將1份吸附劑（如硅膠G）加3份左右的水在研缽中用研杵沿一個方向充分研磨，調(diào)成均勻糊狀物，倒入已準(zhǔn)備好的涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地以直線方向移動涂布器，使硅膠漿均勻地涂布。須注意的是不同廠家不同批號的硅膠G加水量及研磨時間要求有所不同，如加有其他改性劑更是如此?！?，由于國產(chǎn)常用的硅膠顆粒大小分布范圍較寬（10～40μm），如果顆粒分布不夠均勻，而粗顆占比例較多時，涂布的太薄反而降低分離能力，有的品種。涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，再在105～110℃活化約30分鐘，置干燥器中備用。使用前應(yīng)在反射光和透射光下檢查板面及紋理是否均勻，如不均勻，有氣泡或有麻點(diǎn)、有破損或已污染（如灰塵、纖維）者應(yīng)棄去不用。 預(yù)制薄層板分常規(guī)薄層板及高效板兩種，由于商品供應(yīng)來源不一，需注意并記錄生產(chǎn)廠家及生產(chǎn)批號，必要時需測定板效，以保證較好的重現(xiàn)性。在質(zhì)量保證的前提下，應(yīng)盡量選用預(yù)制薄層極，以提高時效和色譜的重現(xiàn)性。 B 點(diǎn)樣 除另有規(guī)定外，點(diǎn)樣用的定量微升毛細(xì)管（或其他符合要求的點(diǎn)樣工具）按規(guī)定吸取溶液后，以垂直方向小心接觸板面使成圓點(diǎn)狀，點(diǎn)樣基線與底邊的距離，視所用板的大小而定，如采用長度為10cm的板，點(diǎn)樣距離底邊以1cm為宜，點(diǎn)間距離視情況為原點(diǎn)直徑應(yīng)不大于3mm；如樣品容量較大，或為了改善分離度，也可點(diǎn)成寬約2～3mm不同長度的條帶。點(diǎn)樣時須注意盡量不要損害薄層表面。一般的自制硅膠G薄層板，板面的牢度不夠，定量測定時需特別注意小心點(diǎn)樣，不要使原點(diǎn)部分的板面破損。 C 展開 點(diǎn)樣后的薄層板置入加有展開劑的薄層展開箱中，密閉，一般采用上行展開，薄層板浸入展開劑深度一般要求溶劑最初的前沿距原點(diǎn)約5mm，展開至規(guī)定展開距后立即將薄層權(quán)取出，晾干，以備檢測。多數(shù)品種展距7～9cm已夠，少數(shù)需用長度為15或20cm的板；展開可在10cm以上。如規(guī)定需用展開劑或其他溶劑的蒸氣預(yù)平衡者可在雙槽展開箱的一側(cè)加入適量的溶劑，如需達(dá)到飽和狀態(tài)，可在展開箱內(nèi)壁貼一被溶劑濕潤的濾紙使展開箱易于被蒸氣平衡，如規(guī)定薄層板需要同時預(yù)平衡者，應(yīng)將薄層板放入箱內(nèi)沒有溶劑的一側(cè)槽中，平衡后再將溶劑傾入此糟中展開。 展開劑要求新鮮配制，如需分層則按規(guī)定要求放置分層后，分取需要的一相（上層或下層）各用。 D 檢測 色譜斑點(diǎn)本身有顏色者可直接在日光下觀察色譜中的色斑，本身在紫外光激發(fā)下可發(fā)射熒光者可直接置紫外光燈下觀察熒光色譜、需加試劑后方能顯色或發(fā)射熒光者，則可將試劑用噴霧器均勻噴灑于薄層板面（或用浸漬法），再按規(guī)定直接觀察或加熱后觀察。浸漬法板面顯色均勻是其優(yōu)點(diǎn)，但有的樣品經(jīng)試劑浸漬后斑點(diǎn)容易被浸潤擴(kuò)散，則不適用。涂布試劑后如加熱顯色需注意控制加熱溫度和時間，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板溫度過高或加熱時間過長易焦化，如用硫酸等試劑則可使板面碳化而影響顯色效果；有的成分加試劑后加熱溫度和加熱時間不同，顯色效果可能有差別、有的品種用蒸氣熏蒸（如碘蒸氣）顯色者，可在密閉器皿中放置適當(dāng)時間至斑點(diǎn)顯色清晰，薄層色譜還可在薄層掃描儀中進(jìn)行光密度掃描或熒光掃描。 ③影響薄層色譜分析的主要因素 常規(guī)薄層色譜因為是一種敞開系統(tǒng)的色譜技術(shù)，與柱色譜的區(qū)別之一是除材料及器材以外，外界環(huán)境條件對被分離物質(zhì)的層析行為影響很大，分離機(jī)制也很復(fù)雜；操作技巧也明顯的影響色譜質(zhì)量；為了充分發(fā)揮薄層色譜技術(shù)在中藥分析方面的優(yōu)勢，提高色譜的分離度和重現(xiàn)性，注意控制影響色譜質(zhì)量的因素是非常重要的。以下所述的幾個方面不僅對定量分析是必須注意的問題，對提高定性分析的質(zhì)量也是不可忽視的。 A．樣品的預(yù)處理及供試液的制備 一般認(rèn)為薄層色譜所用固定相（薄層板）可即用即棄，不怕供試液中雜質(zhì)的污染，因而樣品無需凈化精制。但在實踐中，由于中藥的成分復(fù)雜，未知成分多，供試液中溶出的物質(zhì)較多，其中既有欲測成分也有其他雜質(zhì)。常常由于相互干擾或背景污染而難以得到滿意的分高效果，甚至難以辨認(rèn)，尤其成方制劑更是如此．所以在許多情況下為了得到一個較為清晰的色譜。樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試液得以凈化，往往是一個重要的有時甚至是關(guān)鍵的步驟，制各樣品供試液所用的溶劑一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸點(diǎn)適中；但中藥制劑往往希望將各成分盡量多地提取出來，最常被選用的是甲醇或乙醇，欲測成分和許多其他雜質(zhì)均可能被提取出來。因此供試液的凈化就顯得更為必要。 樣品供試液凈化的方法通常有1．單一溶劑萃取法，2．分段萃取法；3．液液萃取法；4．固液萃取法。 B、薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù) 點(diǎn)樣是薄層色譜的第一步，也是關(guān)鍵的一步，它既關(guān)系到能否得到可以重現(xiàn)的薄層色譜，也關(guān)系到定量測定結(jié)果的準(zhǔn)確與否，因為不良的點(diǎn)樣是測定誤差的最主要的來源。一般在常規(guī)薄層板上原點(diǎn)的直徑不大于3mm，高效薄層板要求原點(diǎn)直徑不大于2mm。點(diǎn)樣量不宜過大，最好控制在10μl以下，如在一個位置重復(fù)多次點(diǎn)樣時，須注意盡量不將原點(diǎn)點(diǎn)成一個空心圈。選用溶劑沸點(diǎn)不宜太高（如正丁醇）或太低（如己醚）。如用乙醚提取，可將最終溶液改用其他非極性溶劑。如用親水性溶劑，或在較高相對濕度環(huán)境下點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后應(yīng)將薄層板再干燥（如真空干燥）。點(diǎn)樣時需注意盡量不要損傷薄層板表面。 C、吸附劑的活性與相對濕度的影響 吸附劑的活性是由吸附劑如硅膠的表面能和表面積決定的。硅膠的硅醇基是親水性基團(tuán)，很易吸附水分子而成為水合硅醇基而失去活性。自制的硅膠薄層板在105～110℃加熱若干時間，就是使水合硅醇基脫水變?yōu)橛坞x硅醇基而活化。反之，活化后的薄層板也可以吸附大氣中的水分子而降低活性。說明硅膠表面吸附水份的作用是可逆的，在日常操作時，當(dāng)活化后的硅膠（或氧化鋁）薄層板從干燥器中取出，自開始點(diǎn)樣到展開前，薄層板一般是暴露在實驗室的大氣中，其活性取決于實驗室環(huán)境的相對濕度。在其他條件相同的情況下，相對濕度對許多樣品色譜質(zhì)量的影響是很明顯的。通常認(rèn)為薄層色譜重現(xiàn)性差，在不同的相對濕度下點(diǎn)樣和展開即是原因之一。控制展開時的相對濕度可在雙槽展開箱的一側(cè)用一定濃度的硫酸溶液，密閉放置一定時間（如15～30分鐘），再加入展開劑于另一側(cè)展開。也可將點(diǎn)樣后的薄層板放入一定的容器中（或特制的濕度控制箱中）內(nèi)有一定濃度的硫酸溶液或其他調(diào)節(jié)相對濕度的無機(jī)鹽水溶液，密閉放置一定時間后，取出，立即在箱中展開。試驗結(jié)果必須有展開時的相對濕度的記錄。控制相對濕度用的硫酸溶液配制可參考下表表 控制相對濕度用的硫酸溶液 相對濕度（%） 所需硫酸溶度（V/V）硫酸（ml）水（ml）32681004257100581006534100721008889D、溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用 薄層色譜與柱色譜的區(qū)別之一就是溶劑的蒸氣相在展開箱中也參與色譜的展開而形成三維的層析過程。展開箱的空間氣體在薄層層析過程中起著重要的作用。在常規(guī)薄層色譜分析中，層析過程是很復(fù)雜的，特別是使用多元又能形成兩相的展開劑時，即有吸附行為也有分配行為。這時，對薄層色譜的層析過程和結(jié)果有很大的影響。在實驗中應(yīng)注意觀察并真實記錄試驗條件，如展開前有無預(yù)平衡，平行時間等。 E、溫度的影響 溫度也是影響層析行為的因素之一。最直觀的影響是被分離物質(zhì)的Rf值和物質(zhì)的相互分離度以及斑點(diǎn)的擴(kuò)散等，在溫差較大的不同地點(diǎn)或時間，其它條件相同展開同樣的樣品，所得色譜可能含有差異。目前還沒有可以控制溫度的展開裝置，因此記錄展開時的溫度也是保證良好重現(xiàn)性的一個措施。6．檢查 中藥制劑檢查項照現(xiàn)行版藥典附錄各有關(guān)通則（如丸劑、散劑、片劑等）項下規(guī)定的檢查項目進(jìn)行檢查，要列出具體數(shù)據(jù)或結(jié)果。如與通則中某項檢查要求不同的，要說明理由及列出具體數(shù)據(jù)；有些品種如還有通則規(guī)定以外的檢查項目時，要說明理由、方法及數(shù)據(jù)，通則以外的劑型要另行制訂要求。 中藥制劑所用藥材均應(yīng)是經(jīng)檢驗符合規(guī)定的藥材，故一般制成制劑后不再作總灰分等檢查。但對新藥，根據(jù)國內(nèi)外要求需作重金屬、砷鹽等有害物質(zhì)的考察，要提供檢測的積累數(shù)據(jù)。必要時，將重金屬、砷鹽列入正文檢查項目中。重金屬、砷鹽檢查項目說明可見藥材申報資料5，檢查及有關(guān)項目說明中有關(guān)重金屬、砷鹽部分。 此外，內(nèi)服酒劑、酊劑是否含有甲醇，可用氣相色譜法進(jìn)行檢測，提供檢測的積累數(shù)據(jù)，必要時列入正文檢測項目中。 中藥制劑的某些品種，除按現(xiàn)行版藥典附錄劑型通則規(guī)定有關(guān)項目檢查外，有的尚需另制訂檢查項目，以保證質(zhì)量。如有的外用藥含醋酸，在此成分揮發(fā)后影響藥品質(zhì)量，應(yīng)將醋酸作為檢查項目列入正文之中。 中藥制劑凡規(guī)定有限度指標(biāo)的品種（指重金屬、砷鹽或甲醇等）要有足夠的數(shù)據(jù)，至申報生產(chǎn)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，必須至少累積10批樣品數(shù)據(jù)。將限度指標(biāo)列入正文之中。凡未列入正文中的檢查項目研究，也應(yīng)提