最新分子試驗(yàn)設(shè)計(jì)(編輯修改稿)
2025-07-27 03:15 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ： ，置于錐形瓶中，TBE緩沖液，微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。待膠液冷卻到65℃（不燙手為宜），加入1μL Gold view混勻，排除氣泡,緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機(jī)玻璃槽（插入樣品槽模板梳子 ）內(nèi) 。靜置30min左右，輕輕晃動拔出梳子。膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負(fù)極），TBE緩沖液淹沒過膠板5mm，用取液器將提取的質(zhì)粒DNA5μL與1μL6上樣緩沖液混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的藍(lán)色指示劑移動到距離膠板邊沿約1~2cm處，停止電泳。 將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中DNA存在處顯示出熒光條帶。：正常情況下會出現(xiàn)兩條條帶（閉環(huán)和開環(huán)質(zhì)粒）。 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 DNA限制性內(nèi)切酶酶切：DNA限制性酶切：生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。pet原核表達(dá)質(zhì)粒是最有效的原核表達(dá)系統(tǒng)之一。 目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。宿主菌帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通過IPTG來啟動表達(dá)。充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50％以上。酶切位點(diǎn)：BamHI NotI ：：實(shí)驗(yàn)一提取的質(zhì)粒pEGFPN3和pET28a ，取液器吸頭，一次性手套：Not I, Bam HI, ddH2O，10buffer，瓊脂糖，Gold view：移液器，臺式高速離心機(jī)，凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，恒溫培養(yǎng)箱：：如① ② μL體系：①號管②號管BSA3μl3μl10xBuffer3μl3μlNot I2μl2μlBam HI2μl2μl質(zhì)粒pET 28a：20μlpEGFPT1：20μl，放入恒溫培養(yǎng)箱370C酶切3h。 ① ② EP管的酶切反應(yīng)液，同時取5μL原質(zhì)粒溶液作對照，進(jìn)行電泳檢測酶切結(jié)果。 連接重組：DNA連接重組： 連接的DNA分子具備的條件：具有相同粘性末端（同種酶切的片段）的DNA分子比較容易連接在一起，因?yàn)橄嗤恼承阅┒巳菀淄ㄟ^堿基配對氫鍵形成一個相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。連接反應(yīng)溫度：理論上講，連接反應(yīng)的最佳溫度是370C，此時連接酶的活性最高。但370C粘性末端分子形成的配對結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此，人們找到了一個最適溫度，即12~160C。此時既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇16
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