最新分子試驗設計(編輯修改稿)
2025-07-27 03:15 本頁面
【文章內容簡介】 ： ，置于錐形瓶中，TBE緩沖液，微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。待膠液冷卻到65℃（不燙手為宜），加入1μL Gold view混勻，排除氣泡,緩慢倒入事先準備的制膠有機玻璃槽（插入樣品槽模板梳子 ）內 。靜置30min左右，輕輕晃動拔出梳子。膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負極），TBE緩沖液淹沒過膠板5mm，用取液器將提取的質粒DNA5μL與1μL6上樣緩沖液混勻，加入膠板的樣品小槽內。將電泳槽與電泳儀接通，調節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的藍色指示劑移動到距離膠板邊沿約1~2cm處，停止電泳。 將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調節(jié)位置居中，波長為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中DNA存在處顯示出熒光條帶。：正常情況下會出現(xiàn)兩條條帶（閉環(huán)和開環(huán)質粒）。 基因表達載體的構建 DNA限制性內切酶酶切：DNA限制性酶切：生物體內能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)。pet原核表達質粒是最有效的原核表達系統(tǒng)之一。 目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬菌體T7強轉錄及翻譯信號控制；表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。宿主菌帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通過IPTG來啟動表達。充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0％以上。酶切位點：BamHI NotI ：：實驗一提取的質粒pEGFPN3和pET28a ，取液器吸頭，一次性手套：Not I, Bam HI, ddH2O，10buffer，瓊脂糖，Gold view：移液器，臺式高速離心機，凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，恒溫培養(yǎng)箱：：如① ② μL體系：①號管②號管BSA3μl3μl10xBuffer3μl3μlNot I2μl2μlBam HI2μl2μl質粒pET 28a：20μlpEGFPT1：20μl，放入恒溫培養(yǎng)箱370C酶切3h。 ① ② EP管的酶切反應液，同時取5μL原質粒溶液作對照，進行電泳檢測酶切結果。 連接重組：DNA連接重組： 連接的DNA分子具備的條件：具有相同粘性末端（同種酶切的片段）的DNA分子比較容易連接在一起，因為相同的粘性末端容易通過堿基配對氫鍵形成一個相對穩(wěn)定的結構。連接反應溫度：理論上講，連接反應的最佳溫度是370C，此時連接酶的活性最高。但370C粘性末端分子形成的配對結構極不穩(wěn)定，因此，人們找到了一個最適溫度，即12~160C。此時既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結構的穩(wěn)定。本實驗選擇16
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