最新分子試驗設(shè)計-資料下載頁
2025-06-30 03:15本頁面
【正文】 鏈 。 按此循環(huán)（變性—復(fù)性—延伸），一般重25~30次，短時間內(nèi)，使目的基因片段擴增2n （n代表循環(huán)次數(shù)）。 DNA模板，4 dNTP，T7正反引物 ，Taq酶，瓊脂糖，Marker DNA，吸頭 10buffer，15 mmol/L MgCl2 PCR熱循環(huán)儀， 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)：由于質(zhì)粒的黏性末端是Not I, Bam HI,兩種限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的，載體和目的基因的粘性末端互補配對形成重組質(zhì)粒，所以在重組質(zhì)粒上也存在Not I, Bam HI的酶切位點，在陽性克隆的細菌中提取質(zhì)粒，雙酶切過后對酶切后的產(chǎn)物檢驗，可以驗證是重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功。 I, Bam HI，10buffer， ，臺式高速離心機，凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng) EP管 BSA 3μL 10buffer 3μL NotⅠ 2μL Bam HⅠ 2μL 重組質(zhì)粒 20μL ，放入恒溫培養(yǎng)箱370C酶切3h。，同時取5μL目的基因溶液作對照，進行電泳檢測酶切結(jié)果。 ，證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成功 ，證明轉(zhuǎn)化失敗，轉(zhuǎn)化后的細菌細胞壁外會附著一些陽性克隆。所以可能會導(dǎo)致PCR結(jié)果成陽性，在實驗當中應(yīng)該避免這一點，方法可以有挑取單克隆菌落后在10ul的雙蒸水或沒有核酸酶的水中吹打幾下，再取2ul作模版，使重組質(zhì)粒得到大量的拷貝。 ：BL21(DE3) 菌株該菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ 噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達非毒性蛋白。 ，重組質(zhì)粒 ：LB培養(yǎng)基，熒光顯微鏡 步驟 ，每200μL解凍的感受態(tài)細胞加入5μL pET28aEGFP質(zhì)粒 ，混勻后冰浴30min，立即置于冰浴5min。 ，于370C搖床中培養(yǎng)1h。期間將200μL的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培養(yǎng)基上，待用。 后，6000r/min 離心5min，去掉上清（約留200μL的培養(yǎng)液），搖勻菌塊。 ，正置培養(yǎng)皿半小時后，370C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)皿過夜。 若觀察到綠色熒光表明實驗成功，若無綠色熒光則說明實驗失敗參考文獻【1】 Lentivirus介導(dǎo)表達多基因的人胚基因工程神經(jīng)干細胞實驗研究 程剛吳兆翔楊華剛馬志簪【2】 高產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌的研究進展【3】 抗菌肽CM4基因克隆及其在畢赤酵母中的表達鑒定【4】 嗜熱子囊菌光孢變種cbhl基因的cDNA克隆及在畢赤酵母的高效表達【5】 細菌質(zhì)粒與基因工程
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