【文章內(nèi)容簡介】 染色時間60min靈敏度最少可見1~3ng背景熒光信號弱DNA條帶的整齊度有無拖尾無有無扭曲無邊緣是否清晰銳利是2不同染料比較分析通過3中新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green?與傳統(tǒng)染料EB的染色視覺效果對比，發(fā)現(xiàn)：1） 在背景信號方面，不管是膠染法還是泡染法，以TAE或TBE為緩沖液，用EB為染料時，電泳后的凝膠在紫外光照射下，背景信號較高，條帶不明顯。而另外三種新型染料則都體現(xiàn)出了背景信號低、樣品信號高的優(yōu)勢，利于觀察條帶。2） 在條帶質(zhì)量方面，使用EB和GenGreen為染料跑出的條帶，條帶都邊緣清晰、無扭曲和拖尾現(xiàn)象。用膠染法和泡染法的效果相當，緩沖液不同對染色效果也無明顯影響；使用GelRed為染料時，在泡染法時條帶質(zhì)量好。但用膠染法染色后的條帶會出現(xiàn)輕微扭曲、邊緣不平整的現(xiàn)象，且DNA濃度越高扭曲現(xiàn)象越嚴重（見圖118）。緩沖液的不同對其無明顯影響；使用SYBR Green?為染料時，在膠染法時條帶會出現(xiàn)拖尾和扭曲現(xiàn)象，且DNA濃度越高拖尾、扭曲越嚴重（見圖120）。而泡染法則不會出現(xiàn)這些現(xiàn)象，條帶清晰質(zhì)量好。在緩沖液TAE中扭曲拖尾比在TBE中更為嚴重。3） 在靈敏度方面，不管何種染色方法、何種緩沖液，4中染料都能顯出出8ng以上的DNA。且電泳結(jié)果顯示3種新型染料的靈敏度都高于EB。在312nm紫外光照射下，GelRed與SYBR Green?的靈敏度相當，GenGreen次之，EB靈敏度最低。緩沖液的不同對靈敏度的影響不大。綜合比較背景信號、條帶質(zhì)量和靈敏度三個因素來考量各染料的視覺效果，得出以下結(jié)論：使用膠染法時，GenGreen的視覺效果優(yōu)于EB；使用泡染法時，GenGreen、GelRed和SYBR Green?的視覺都效果優(yōu)于EB。、以TAE為緩沖液、4種染料電泳對比圖、以TBE為緩沖液、4種染料電泳對比圖、以TAE為緩沖液、4種染料電泳對比圖、以TBE為緩沖液、4種染料電泳對比圖染料緩沖液染色方法視覺效果靈敏度（ng）背景熒光信號有無拖尾有無扭曲邊緣是否清晰EBTBE膠染較強無無是8泡染較強無無是5~8TAE膠染較強無無是8泡染較強無無是5~8GelRedTBE膠染弱無有是3泡染弱無無是1TAE膠染弱無有是3泡染弱無無是1GenGreenTBE膠染弱無無是3泡染弱無無是5TAE膠染弱無無是3泡染弱無無是5SYBR Green? TBE膠染弱有有否1泡染弱無無是1~3TAE膠染弱有有否1~3泡染弱無無是1~3EB：具有強毒性、強致癌性和高誘變性。GelRed：由美國安全認定無毒，其水溶染色劑通過美國環(huán)保局安全認定，廢棄物可直接倒入下水道，而不會造成任何環(huán)境污染。獨立的測試服務(wù)公司（ Litron Laboratories, Inc. ）進行的標準艾姆斯氏測試結(jié)果表明， 在 μ g /mL （該濃度遠高于推薦用于電泳后染色的 約 4 μ g/mL 的 3X 染色液 ）濃度下，僅在 S9 代謝活化時有微弱的誘變性[20]。誘變性遠遠低于EB。GenGreen：獨特的油性和大分子量特點使其不能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，艾姆斯氏試驗結(jié)果表明，艾姆斯氏測試結(jié)果表明，GenGreen在凝膠染色濃度下完全沒有誘變性，因此完全沒有致癌毒性。[21]。SYBR Green I：屬花箐染料，能透過細胞膜進入活體細胞內(nèi)，但容易生物降解，不會在體內(nèi)殘留，低毒。誘變性低于EB[22]。 對DNA的遷移影響EB：對核酸遷移的影響小于 SYBR Green I[23]。GelRed：對核酸遷移的影響小于 SYBR Green I[20]。GenGreen：對核酸遷移的影響小于 SYBR Green I[21]。SYBR Green I：對核酸遷移有一定影響，會造成大片段的滯后[22]。 可重復利用率EB：可重復利用率高，穩(wěn)定不易分解，泡染的染色液可多次重復使用。GelRed：可重復利用率低，通過實驗發(fā)現(xiàn)，60ml的3 染色液一般只能泡染一塊膠。染第二塊條帶顏色暗，第三塊基本看不到條帶。GenGreen：可重復利用率低，通過實驗發(fā)現(xiàn)，60ml的3 染色液一般只能泡染一塊膠。染第二塊條帶顏色暗，第三塊基本看不到條帶。SYBR Green I：可重復利用率低，易分解， 3 染色液不可長期保存使用。60ml的3 染色液一般只能泡染一塊膠。染第二塊條帶顏色暗，第三塊基本看不到條帶。EB：穩(wěn)定，可在室溫下保存。GelRed：非常穩(wěn)定，可長期在室溫下保存。GenGreen：室溫下在酸或堿緩沖液中極其穩(wěn)定，耐光性強。適用于使用微波或其它加熱方法制備瓊脂糖凝膠；SYBR Green I：在常用的微堿性電泳緩沖溶液或預制凝膠中會快速降解，穩(wěn)定性差[24]。因此實驗時配膠和點樣的速度要快。EB：對于1kb的λDNA，電壓100V時，電泳時間為20min，泡染時間為60min。GelRed：時間同EB。條帶遷移率與EB相當。GenGreen：時間同EB。條帶遷移率與EB相當。SYBR Green I：時間同EB。條帶遷移率與EB相當。EB：50元/1mlGelRed：980元/500ul GenGreen：400元/500ul SYBR Green I 10000x,DMSO：450元/50ul（以上價格均查自鼎國網(wǎng)上價格表）染料毒性對DNA的遷移影響可重復利用率穩(wěn)定性泡染時間價格EB強小高高60min低GelRed無小低高60min中GenGreen低小低高60min中SYBR Green? 低較大低差60min高3實驗結(jié)果從多個方面比較三種新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green?與傳統(tǒng)染料EB，通過一系列實驗得出以下結(jié)果：1） 在視覺效果方面，雖然GelRed、GenGreen、SYBR Green?的靈敏度都高于EB，但在膠染法時，用SYBR Green?預制的凝膠上的條帶會出現(xiàn)拖帶和扭曲現(xiàn)象，GelRed預制的凝膠上的條帶會發(fā)生扭曲現(xiàn)象。而只有GenGreen不管用何種染色方法，都能保證條帶的清晰度，不扭曲、不拖帶,雖然GenGreen的靈敏度不及SYBR Green?和GelRed，但其視覺效果最好最穩(wěn)定。2） 在毒性方面，3中新型染料的毒性和致突變性都低于EB。其中GelRed和GenGreen無毒，SYBR Green?低毒。3） 在對DNA的遷移影響方面，SYBR Green?對DNA的遷移影響最大，GelRed、GenGreen和EB對DNA的遷移影響都較小。4） 在可重復利用率方面，EB的可重復利用率高，而GelRed、GenGreen和SYBR Green?的可重復利用率都比較低。5） 在染料本身的穩(wěn)定性方面，SYBR Green?的穩(wěn)定性最差，GelRed、GenGreen的穩(wěn)定性都與EB相當。6） 在時間成本方面，用何種染料對電泳的速率基本沒有影響。7） 在價格方面，染料價格從低到高依次為：EB、GenGreen、GelRed、SYBR Green?。EB不但價格最低，加上其可重復利用率高，更加節(jié)省了成本。GenGreen和GelRed價格適中，一般實驗室用途可以接受。而SYBR Green?價格昂貴，在使用泡染法時雖然染色效果好但是要用去大量染料，花費昂貴。第4章 討論1實驗注意事項1） 實驗前確認好所有所需溶液需要的量然后一次配置，以保證試驗中的平行試驗間的可對比性，試驗結(jié)果的討論都是建立在單一變量的基礎(chǔ)上。2） 電泳的電壓要恒定，在本實驗中電壓均為100V。3） 取凍存的λDNA稀釋時，在取樣前要將λDNA彈勻或適當離心，避免λDNA濃度不均而取出的樣品濃度不準確。同理，在每次點樣前都要將EP管中的λDNA彈勻或適當離心。4） 制膠模具要保持清潔無污染。首先要將制膠模具清洗干凈，要注意核酸、蛋白及其它可見雜物進入凝膠。瓊脂糖應(yīng)完全熔化呈清澈、透明的液體。5） 溶解瓊脂糖時，在微波爐內(nèi)反復加熱2~3次，且每次加熱后要輕輕搖勻，使氣泡都跑出。6） 膠染法滴加染料時，要待瓊脂糖溶液稍冷再滴加染料，充分搖勻,及時倒入制膠槽,動作要輕,避免產(chǎn)生氣泡。若溫度過低,則膠冷卻后不均一,電泳譜帶彎曲。以冷卻到不燙手為宜（60℃左右）。7） 選擇合適的梳子，每次制膠時都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm,否則,拔梳板時易損壞凝膠孔底層,導致點樣后樣品滲漏。8） 要保證膠的凝固時間,確保凝膠形成穩(wěn)定均一的孔徑,經(jīng)實踐發(fā)現(xiàn)一般在膠冷卻30~45 min后即完全凝固，可拔梳子點樣電泳。9） 拔梳子時弱不好拔，可滴加一些緩沖液。10） 電泳槽中的電泳緩沖液高度要沒過凝膠約1mm。11） 配膠用的緩沖液必須與電泳槽中的緩沖液相統(tǒng)一。12） 電泳時間不是固定的。電泳時可透過透明電泳槽蓋觀察，一般是前沿指示劑達到每排膠孔距離的2/3處時停止電泳。13） DNA與6上樣液（Loading Buffer）的比例應(yīng)該是5：1。由于小體積溶液不好點樣且點樣時微量的損失對樣品濃度的影響也比較大，因此使用10ul樣品混合2ul的6上樣液點樣。14） 上樣緩沖液一般采用甘油增加樣品比重,使用時應(yīng)先搖勻后再取用,否則樣品會漂移散失.15） 泳緩沖液一般可重復使用多次,但若出現(xiàn)渾濁情況就應(yīng)及時更換,否則影響電泳分辨率。每次電泳前要將電泳緩沖液重新?lián)u勻,每次電泳后,兩極PH相差較大,陽極呈堿性,陰極呈酸性,這樣會造成核酸泳動消失,導致電泳失敗。16） 3 GelRed 、3 GenGreen染色液可以大量制備，在室溫下避光保存直至用完。而SYBR Green?由于其性質(zhì)不穩(wěn)定，其3染色液不可長久保存，要現(xiàn)配現(xiàn)用。2問題及討論1） λDNA的降解為保證試驗中的平行試驗間的可對比性，實驗前確認好所需溶液需要的量然后一次配置，試驗結(jié)果的討論都是建立在單一變量的基礎(chǔ)上。但稀釋好的λDNA經(jīng)過一段時間后電泳發(fā)現(xiàn)拖帶、條帶不清晰現(xiàn)象，排除配膠時膠槽不清潔、瓊脂糖未完全溶解、梳子沒拔好等原因，分析這可能是DNA發(fā)生了降解，影響電泳結(jié)果。應(yīng)當在實驗的準備階段，先取若干份λDNA母液分別裝入EP管中，20℃凍存。每隔一段時間（一星期左右）要取出凍存的分裝λDNA重新稀釋濃度。這樣既可以兼顧實驗的平行性，又能避免由于λDNA降解而引起的實驗誤差。2） 泡染液染色次數(shù)GelRed和GenGreen的染料說明書上顯示單次使用的3染色液可重復使用 3 次左右。而實際實驗時，染第二塊膠時條帶已經(jīng)很暗，染第三塊時基本看不到條帶。經(jīng)分析，原因可能為點樣的λDNA濃度很低，因此在染料量偏少的情況下染色效果不佳。因此在實際操作時，60ml的3染色液（含染料12ul）只能染一塊膠。3） 染料背景熒光信號背景熒光信號，即膠塊本身的亮暗程度，是由于凝膠本身吸收了少量熒光染料而顯色。通過分析不同染料的電泳圖發(fā)現(xiàn)，EB的背景熒光信號較高，而GelRed、GenGreen和SYBR Green I的背景熒光信號都較弱。背景熒光信號低，樣品熒光信號高，則對比明顯，更容易觀察到條帶。EB的背景熒光信號較高，可能是因為EB分子容易與瓊脂糖分子結(jié)合，從而使膠塊染色。4） SYBR Green I拖尾問題SYBR Green I有拖尾問題可能與其跟DNA的結(jié)合方式有關(guān)。SYBR Green I是花菁染料，通過靜電吸引與DNA結(jié)合,由于DNA帶的負電是供電子基團，而此染料帶正電，因此相互吸引，并且由于DNA帶的負電是供電子基團，熒光增強。而EB、GelRed和GenGreen的染色原理都是直接嵌入DNA堿基對之間。據(jù)此推測靜電吸引可能會影響DNA的遷移率，因此在膠染法時會出現(xiàn)條帶扭曲、拖帶的現(xiàn)象，而泡染法時則不會出現(xiàn)此類現(xiàn)象。5） SYBR Green?的靈敏度根據(jù)文獻資料，SYBR Green?的靈敏度極高，可檢出20pg DNA，高于EB染色法1025倍[19]?？墒窃诒緦嶒炛袥]有體現(xiàn)出這么高的靈敏度。經(jīng)查閱資料，發(fā)現(xiàn)SYBR Green I 的最大吸收峰在藍綠可見光區(qū)，而不在紫外區(qū)，因此SYBR Green I在藍盾174?？梢姽庀盗袃x器下觀測具有更高的靈敏度[25]。其在紫外區(qū)300nm～380nm也有一個吸收峰，使其染色結(jié)果也可以使用紫外光相關(guān)設(shè)備進行分析。本實驗采用的是312nm激發(fā)的UV凝膠成像系統(tǒng)，因此達不到SYBR Green I的最大靈敏度。資料顯示，SYBR Green I的最佳使用方法是“電泳后浸膠染色”，但是由于其價格昂貴，“浸膠染色”的染料費用很高。所以國內(nèi)許多實驗室使用所謂的“樣品預染色方法”，即電泳前將染料直接加入樣品中染色，而這種染色方法的靈敏度較低，與EB染色法相當或略低[26]。本實驗并未采用染樣品法。而用SYBR Green?膠染法及泡染法染色后的凝膠，在紫外光下，顯示其靈敏度還是略高于EB，與GelRed 相當。6） GelRed的條帶扭曲問題既然跟DNA的結(jié)合方法與EB和GenGreen一樣，為什么只有GelRed出現(xiàn)了膠染法時濃度較高條帶發(fā)生扭曲的現(xiàn)象呢？據(jù)推測，可能與染料本身的構(gòu)型和插入DNA位置的不同有關(guān)。EB含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。它與DNA的結(jié)合沒有堿基序列特異性,直接嵌入DNA堿基對之