山羊褪黑激素受體1a基因hinf酶切多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析本科畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2025-07-25 13:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 科學(xué)儀器廠梯度 PCR 儀 T1 Thermo cyler 德國 Biometra 公司冷凍離心機(jī) Centrfuge 5810 德國 eppendorf 公司恒溫?fù)u床 HS80 中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠自動(dòng)雙重純水蒸餾器 SZ93 上海亞榮生化儀器廠紫外分析儀 UVIV 北京市新科技應(yīng)用研究所電泳槽 DYYIII 北京六一儀器廠穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳議 DYY2 北京六一儀器廠手提式高壓滅菌鍋 YXQSG46280A 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠超純水儀 WaterPro 美國 LABCONCO 公司移液器1ml；200μl；40μl； 10μl；芬蘭 Labsystems 公司 主要試劑的配置1) 1M ： Tris堿溶于800ml雙蒸水中，加濃鹽酸調(diào)至pH=，定容到1000ml。高壓滅菌，室溫保存；2) EDTA（pH=）： Na2EDTA2H2O溶于800ml雙蒸水中，加入NaOH（約20g）調(diào)至pH=，定容到1000ml。高壓滅菌，室溫保存；3) 10%SDS：稱取50g SDS加熱溶于400ml雙蒸水中，定容至500ml。高壓滅菌，室溫保存；4) 抗凝劑（）：量取200ml EDTA加入雙蒸水定容至500ml。 用于基因組DNA提取的溶液的配制1) 蛋白酶K：稱取200mg蛋白酶K溶于10ml雙蒸水，以1ml分裝，20℃冷凍保存；2) 氯仿/異戊醇（24:1）：量取480ml氯仿，加入20ml異戊醇，混勻；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（或設(shè)計(jì)）93) 3M NaAc：稱取NaAc3H 2O溶于400ml雙蒸水中，用HAc調(diào)至pH=，加水定容至500ml。高壓滅菌，室溫保存；4) TE緩沖液：100mM Triscl（pH＝） ，1mM EDTA（pH＝） 。 用于瓊脂糖凝膠電泳及檢測溶液的配制1) 50TAE儲(chǔ)備液： 稱取242g Tris堿溶于750ml雙蒸水中， HAc、100ml EDTA（pH＝） ，加水定容至1000ml；2) 5TBE儲(chǔ)備液：稱取54g ，加入20ml EDTA（pH＝） ，加水定容至1000ml；3) 6上樣緩沖液：%溴酚蘭，%二甲苯青，15%Ficoll聚蔗糖；4) 溴化乙錠（EB，10mg/ml）: EB，攪拌使完全溶解，轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，錫箔包裹。 用于聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的溶液的配制1) 30% 丙烯酰胺（丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺＝29:1）:700ml雙蒸水中加入290g丙烯酰胺，10g甲叉雙丙烯酰胺，攪拌使完全溶解，加水定容至1000ml，4℃保存；2) 10% 過硫酸銨：稱取1g過硫酸銨溶于8ml雙蒸水，定容至10ml；3) 10% 乙醇：量取50ml無水乙醇溶于450ml水中，混勻；4) 1% HNO3：量取15ml濃HNO 3溶于985ml雙蒸水中，混勻；5) % AgNO3：稱取1g AgNO 3溶于500ml雙蒸水中，置于棕色試劑瓶；6) 3% Na2CO3（%甲醛）：稱取30g無水Na 2CO3溶于900ml雙蒸水中，加入，定容至1000ml；7) 3% HAc：量取30ml冰HAc溶于970ml雙蒸水，混勻。 方法 DNA 的提取從山羊頸靜脈采血10ml，放入裝有抗凝劑（）的離心管中，6000r/min離心15min，棄上清，吸取白細(xì)胞沉淀（參雜少量紅細(xì)胞）于另一離心管中；加入兩倍體積雙蒸餾水（滅菌） ，搖勻沉淀，靜置10min～15min，破碎紅細(xì)胞；6000r/min離心15min，輕輕棄去上清，留白細(xì)胞沉淀；加入1SET 5ml，蛋白酶K（10mg/ml） 200ng/ml，10% SDS 250μl至%，55℃水浴消化過夜；加入等體積飽和平衡酚輕輕搖勻，12022r/min離心15min，輕輕吸取上層水相于另一離心管中，棄下相苯酚；重復(fù)上步；加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1） ，輕輕搖動(dòng)10min，12022r/min離心15min，輕輕吸取上層水相于另一離心管中，棄下層有機(jī)相；加入等體積氯華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（或設(shè)計(jì)）10仿/異戊醇（24:1） ，輕輕搖動(dòng)10min，12022r/min離心15min，輕輕吸取上層水相于另一離心管中，棄下層有機(jī)相；加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)管子，DNA呈絮狀析出，用1ml吸頭（滅菌）吸出DNA沉淀，加入預(yù)冷無水乙醇洗滌一次，離心棄去無水乙醇，再用75%乙醇漂洗2次，小心吸去乙醇，待DNA沉淀自然干燥后，加入適量TE（100μl～300μl）溶解。引物參考滑國華等（2022）進(jìn)行設(shè)計(jì)，序列如下：上游引物: 5’ACGACCCGAGGATCTATTCC 3’ 下游引物: 5’ATATAAGTCCTGGGGCTTCAGATT 3’ ，在下游引物中引入錯(cuò)配堿基 A，當(dāng)突變位點(diǎn)為 G（即反義鏈為 C）時(shí)，可形成 HinfⅠ（GATTC）酶切位點(diǎn)；當(dāng)突變位點(diǎn)為 A（即反義鏈為 T）時(shí)，該酶切位點(diǎn)缺失，由此可進(jìn)行基因型判定。 擴(kuò)增及其電泳檢測 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（表 2）表 2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μl）Table 2 PCR amplification of the response system （20μl）反應(yīng)體系response system反應(yīng)體積 V（μl） response volume（μl）滅菌蒸餾水 10Buffer 2Mg2+ dNTP 上游引物 下游引物 Taq DNA 聚合酶（5 U/ml） 模板 DNA 1Total 20 退火溫度的優(yōu)化利用 PCR 機(jī)器上都有一個(gè) Gradient 功能，在一次 PCR 過程中，對機(jī)器中不華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（或設(shè)計(jì)）11同位點(diǎn)的反應(yīng)采用不同的退火溫度，一般在第一次實(shí)驗(yàn)中，采用引物溶點(diǎn)上下10 度設(shè)置退火溫度梯度。每個(gè)溫度梯度一個(gè)反應(yīng)，最后電泳檢測并比較各個(gè)退火溫度的條帶效果，得到最好結(jié)果。本試驗(yàn)中退火溫度設(shè)定為 55－65℃，結(jié)果表明，退火溫度 60℃時(shí)，無非特異性帶，目的條帶最為清晰。 PCR 反應(yīng)程序（表 3）表 3 PCR 反應(yīng)程序Table 3 PCR amplification of the response term步驟stepsPCR 反應(yīng)條件PCR reaction conditions溫度temperature時(shí)間time1 預(yù)變性 95℃ 5min2C 變性 95℃ 30sec3C 退火 60℃ 30sec4C 延伸 72℃ 30sec5 延伸 72℃ 7min6 保溫 16℃ 10min第二步至第四步循環(huán) 35 次。 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 %瓊脂糖凝膠電泳檢測， EB 染色，利用 BIORAD 凝膠成相系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，記錄結(jié)果并拍照。 瓊脂糖凝膠電泳方法（1） 灌膠將透明膠帶粘于灌膠模槽的兩端，制成灌膠模。放入梳子。將模放于水平臺上。取一燒杯，放入：瓊脂糖 g； 1TAE 50 ml?；靹颍訜?，至瓊脂糖徹底溶解。待稍冷后，加入 5ul 飽和的溴乙錠，輕晃混勻，然后輕輕倒入模子。用吸頭吸去表面小泡。待冷卻成膠。（2）上樣電泳 輕輕拔出
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