農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2024-07-25 13:49 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 5μl RNase(10mg/ml), 37℃保溫30min。（10）用等體積氯仿：異戊醇(24:1)抽提1～3 次（視材料而定）（11）室溫4，000rpm 離心10min，吸上清。（12）上清液中加入1/10 體積4M NaCl 溶液后，加入2 倍體積無(wú)水乙醇，室溫放置20min 后，10，000rpm 離心5min，沉淀DNA。（13）沉淀用75％乙醇洗滌2～3 次，干燥后溶入適量的TE buffer(50μl)中備用。 PCR鑒定用CTAB法提取得到的煙草基因組DNA為模板［1012］，用GmftsH基因特異性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下劃線標(biāo)示為attB1位點(diǎn))；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACATTG(下劃線標(biāo)示為attB2位點(diǎn))；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以野生型和ddH2O為陰性對(duì)照，含有目的基因的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系20ul：Buffer(Mg2+)2ul，dNTP ，Taq ，上、模板DNA 1ul，最后用ddH2O補(bǔ)足至20ul。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)于PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，下一步進(jìn)行提取總RNA，進(jìn)行cDNA的合成。最后通過(guò)RTPCR反應(yīng)進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株GmftsH基因在轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)［1317］。 轉(zhuǎn)基因煙草RNA的提?。?）采用天跟時(shí)代（TIANGEN）公司的Total RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA用的槍頭、%的DEPC溶液12個(gè)小時(shí)以上，隨后取出高壓滅菌。開(kāi)始提取Total RNA之前，實(shí)驗(yàn)所用的鑷子、小鑰匙及研缽等均需在酒精中灼燒30分鐘左右。（2）80℃保存的大豆各組織材料放入小研缽中，加入液氮快速研磨至粉末，隨后立即加入1000ul的裂解液RZ，在研缽中充分研磨。（3）取出研磨好的勻漿液，1530℃放置5分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。（4）12000rpm離心5分鐘（4℃），取上清，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無(wú)RNase的離心管中。 （5）加入200ul的氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15秒，室溫放置3分鐘。（6）12000rpm離心10分鐘（4℃），樣品會(huì)分成三層：黃色的有機(jī)相，中間層和無(wú)色的水相，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作。（7），混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR中，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。（9）向吸附柱CR中加入700ul的漂洗液RW，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉收集管中的廢液。（10）將吸附柱CR放入2ml收集管中，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉廢液。（11）將吸附柱CR轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入3050ul的RNasefree ddH2O，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘（4℃）。（12）將提取好的RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)后放80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩? cDNA的合成cDNA合成依據(jù)TaKaRa試劑公司SYBR174。 PrimeScript174。 RTPCR Kit II試劑盒中cDNA合成產(chǎn)品TaKaRa Code：DRR037A操作說(shuō)明。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表21表11 反轉(zhuǎn)錄體系試劑 使用量5PrimeScript174。 Buffer 2μlPrimeScript174。 RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer Random 6 mers Total RNA 2ulRNase Free ddH2O up to 10μl 反轉(zhuǎn)錄程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)） 85℃ 5 sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA采用煙草內(nèi)參基因actin檢測(cè)質(zhì)量，并保存與20℃。內(nèi)參actin上游引物A1：539。 CCTCAACCCAAAGGTCAACAG3’內(nèi)參actin下游引物A2：539。GACCAGCGAGATCCAAACGAA3’ RTPCR檢測(cè)將反轉(zhuǎn)得到的cDNA進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。引物序列采用GmftsH基因特異性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下劃線標(biāo)示為attB1位點(diǎn))；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACA
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