農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-免費閱讀
【正文】 致謝：本研究工作是在導(dǎo)師XX教授精心指導(dǎo)下完成的。而在農(nóng)桿菌感染外植體后，傷口處的細胞會因過敏反應(yīng)而導(dǎo)致褐化，從而嚴(yán)重影響再生芽的分化頻率和轉(zhuǎn)化頻率。苗齡對外植體再生能力的影響，是因為考慮到外植體的葉齡和生理狀況對轉(zhuǎn)化的影響較大，因為其再生能力不同對農(nóng)桿菌浸染的敏感性不同。 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測（PCR、RTPCR） 轉(zhuǎn)基因植株的獲得將構(gòu)建好的植物過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，潮霉素初篩后得到組培轉(zhuǎn)化煙草苗，轉(zhuǎn)化流程如圖31。而當(dāng)浸染時間達到10—12min時，煙草葉外植體傷口變褐、腐化，最終由于農(nóng)桿菌生長過于旺盛，選擇培養(yǎng)基難以抑制其生長而使外植體全部被污染，完全不能轉(zhuǎn)化。分別將菌液稀釋40倍，感染3mni后共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入含潮霉素 50mg/L及Carb mg/L的FI分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)［1820］。 RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer Random 6 mers Total RNA 2ulRNase Free ddH2O up to 10μl 反轉(zhuǎn)錄程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)） 85℃ 5 sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA采用煙草內(nèi)參基因actin檢測質(zhì)量，并保存與20℃。（10）將吸附柱CR放入2ml收集管中，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉廢液。（3）取出研磨好的勻漿液，1530℃放置5分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。PCR反應(yīng)體系20ul：Buffer(Mg2+)2ul，dNTP ，Taq ，上、模板DNA 1ul，最后用ddH2O補足至20ul。（5）上清液中加入2/3 體積的異丙醇(2030ml)，輕緩顛倒混和均勻，室溫放1020min。(4) 生根培養(yǎng) 植株長大后，切去多余的愈傷保留整株的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中MS3（1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA ），讓其生根。注意：要保持葉片新鮮平整，切取外植體盡量避開葉脈［9］。 培養(yǎng)基 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB培養(yǎng)基：酵母提取物（5g/l）+蔗糖（5g/l）+蛋白胨（5g/l）+七水硫酸鎂（）+瓊脂（15g/l）。在已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約有80％是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的［1］。最后通過RTPCR反應(yīng)進行陽性轉(zhuǎn)基因植株GmftsH基因在轉(zhuǎn)錄水平的檢測，在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠擴增出特異條帶，而在野生型煙草對照中沒有檢測到特異條帶，說明該基因在RNA水平上得到表達。1 材料與方法 材料 植物材料煙草三生煙種子，將野生型煙草種子種植在營養(yǎng)土中，25℃條件下培養(yǎng)4060天左右。0)（4）氯仿:異戊醇：按體積比24:1混合平衡氯仿和異戊醇，放于棕色試劑瓶中，4℃保存。 農(nóng)桿菌侵染外植體及培養(yǎng)(1) 侵染 將外植體放入上述（5）的菌懸液中，震蕩45分鐘，使農(nóng)桿菌與外植體傷口部位充分接觸，將外植體從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS1固體培養(yǎng)基上（葉片光滑面朝上），用封口膜封好后，在25℃的組培室共培養(yǎng)2天。（3）于65℃，并且加上40μl 巰基乙醇，中間溫和的混合幾次。（12）上清液中加入1/10 體積4M NaCl 溶液后，加入2 倍體積無水乙醇，室溫放置20min 后，10，000rpm 離心5min，沉淀DNA。 轉(zhuǎn)基因煙草RNA的提?。?）采用天跟時代（TIANGEN）公司的Total RNA提取試劑盒進行RNA用的槍頭、%的DEPC溶液12個小時以上，隨后取出高壓滅菌。（7），混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。 RTPCR Kit II試劑盒中cDNA合成產(chǎn)品TaKaRa Code：DRR037A操作說明。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。 侵染時間對轉(zhuǎn)化率的影響用農(nóng)桿菌LBA44O4菌液感染煙草葉外植體，在轉(zhuǎn)化方法相同的條件下改變農(nóng)桿菌浸染外植體的時間，分別以35min、68min、1012min來進行，比較其對污染率和轉(zhuǎn)化效率的影響。而處在分裂狀態(tài)的細胞更易整合外源DNA。M P — WT 1 2 3 4 5 6 7 8圖32 轉(zhuǎn)GmftsH基因植株的PCR檢測M：DL5000；P：陽性質(zhì)粒對照；：ddH2O；WT:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 PCR analysis of transgenetic GmftsH plantsM：DNA Marker；P：PCR result of plasmid of pMDC83GmftsH；：ddH2O；WT:Wide type；18：Transgenic plantsWT1 WT2 1 2 3 4 5 6 7 8圖33
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1