【正文】 胞產(chǎn)生一定程度的質(zhì)壁分離，使農(nóng)桿菌易于接觸傷口周圍的細(xì)胞。試驗時，曾以不稀釋的農(nóng)桿菌菌液來浸染外植體，結(jié)果經(jīng)未稀釋菌液浸染的外植體全部褐化死亡，無轉(zhuǎn)化芽生成。她耐心的指導(dǎo)、孜孜不倦的教誨、勤奮嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度將使學(xué)生終生受益。當(dāng)外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡時間達(dá)到8一12min時，外植體全部被污染，完全不能被轉(zhuǎn)化。 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響農(nóng)桿菌浸染植物后，其TDNA要轉(zhuǎn)移并整合到植物體內(nèi)需要一定的時間，所以，外植體感菌后還需在無抗生素的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)一段時間,將其時間設(shè)為0d、3d、5d:表23共培養(yǎng)時間對芽分化的影響共培養(yǎng)時間/天 污染率/% 平均出抗性芽數(shù)/個 0 0 3 5 由實驗結(jié)果可看出，共培養(yǎng)3d的芽分化率比0d的要高一些，因為在這種情況下，感菌時間長有利于農(nóng)桿菌的侵入，而共培養(yǎng)5d的外植體污染較嚴(yán)重，綜合外植體污染情況及出芽率高低得出最佳共培養(yǎng)時間為3d。 CCTCAACCCAAAGGTCAACAG3’內(nèi)參actin下游引物A2：539。 （5）加入200ul的氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15秒，室溫放置3分鐘。（7）用4ml 75％乙醇洗滌沉淀2 次以除去鹽（置于20℃冰箱放置過夜）（8）倒去75％乙醇，37℃干燥(20min)，溶于600μl TE buffer，轉(zhuǎn)移至eppendorf管。(2) 以1%的接種量接種于100mlYEB液體培養(yǎng)基中（內(nèi)含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28℃，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600=）。該實驗旨在建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效快速的煙草遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，為分子生物學(xué)和植物基因工程的研究提供較好的技術(shù)基礎(chǔ)。而FtsH基因廣泛分布于原核生物和真核生物中，其生物學(xué)功能也多種多樣。(3) 無菌狀態(tài)下，將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)過4000rpm(4℃)離心10分鐘，棄去上清。（9）加入5μl RNase(10mg/ml), 37℃保溫30min。（6）12000rpm離心10分鐘（4℃），樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。GACCAGCGAGATCCAAACGAA3’ RTPCR檢測將反轉(zhuǎn)得到的cDNA進行RTPCR檢測。 預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響一般認(rèn)為，外植體的預(yù)培養(yǎng)可使傷口周圍的細(xì)胞得以恢復(fù)，如愈合過程中分泌的酚類物質(zhì)誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因啟動?？赡苁且驗樵诰褐薪輹r間太長，外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐。值此論文完成之際，謹(jǐn)向恩師表示我最誠摯的感謝 本論文的主要工作是在XX，感謝學(xué)校所提供的完善的實驗設(shè)備和實驗材料，同時要感謝此過程中，XX學(xué)長所給予我的精心指導(dǎo)和熱情幫助。同時農(nóng)桿菌菌液對外植體有一定的毒害作用，這可能與細(xì)菌過量分泌一些毒性物質(zhì)有關(guān)。而處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。（7），混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。（12）上清液中加入1/10 體積4M NaCl 溶液后，加入2 倍體積無水乙醇，室溫放置20min 后，10，000rpm 離心5min，沉淀DNA。 農(nóng)桿菌侵染外植體及培養(yǎng)(1) 侵染 將外植體放入上述（5）的菌懸液中，震蕩45分鐘，使農(nóng)桿菌與外植體傷口部位充分接觸，將外植體從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS1固體培養(yǎng)基上（葉片光滑面朝上），用封口膜封好后，在25℃的組培室共培養(yǎng)2天。1 材料與方法 材料 植物材料煙草三生煙種子，將野生型煙草種子種植在營養(yǎng)土中，25℃條件下培養(yǎng)4060天左右。在已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約有80％是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的［1］。注意：要保持葉片新鮮平整，切取外植體盡量避開葉脈［9］。（5）上清液中加入2/3 體積的異丙醇(2030ml)，輕緩顛倒混和均勻，室溫放1020min。（3）取出研磨好的勻漿液，1530℃放置5分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer Random 6 mers Total RNA 2ulRNase Free ddH2O up to 10μl 反轉(zhuǎn)錄程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)） 85℃ 5 sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA