農(nóng)學院本科生-農(nóng)桿菌介導gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文(參考版)
2025-07-01 13:49本頁面
【正文】 值此論文完成之際，謹向恩師表示我最誠摯的感謝 本論文的主要工作是在XX，感謝學校所提供的完善的實驗設備和實驗材料，同時要感謝此過程中，XX學長所給予我的精心指導和熱情幫助。從論文的選題、整個實驗的實施及論文的寫作全部過程中，導師傾注了大量的心血。其中模板的濃度和純度、Tqa酶、引物、dNTP、退火溫度對PCR反應的影響尤其明顯，如果某個因素沒有掌握好，會導致產(chǎn)生非特異性條帶或產(chǎn)生的特異條帶較弱甚至消失，因此在進行PCR擴增之前，建立一個合適的反應體系很重要。本實驗煙草轉(zhuǎn)化植株的分子檢測采用PCR檢測，PCR是最常用的一種分子生物學檢測方法，具有材料用量少，檢測方便，適合于大批量樣品分析等優(yōu)點，是早期檢測的好方法。本實驗比較了共培養(yǎng)0d、3d、5d的效果，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3d為最佳共培養(yǎng)時間為。而卡那霉素加入時間對轉(zhuǎn)化作用影響很大，如果把感染后的外植體馬上轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，細胞很難在含有高濃度的卡那霉素上存活并誘導成芽。可以看出，當農(nóng)桿菌菌液濃度較高(僅稀釋10倍時)，決大部分的葉外植體都腐化死亡掉，而當農(nóng)桿菌菌液濃度較低(稀釋30倍時)，葉外植體都能存活并分化出芽。同時農(nóng)桿菌菌液對外植體有一定的毒害作用，這可能與細菌過量分泌一些毒性物質(zhì)有關(guān)。可能是因為在菌液中浸泡時間太長，外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐。另外，分生組織及伴有活躍細胞分裂的外植體對農(nóng)桿菌的浸染最為敏感，故一般認為幼嫩的外植體比老的外植體好［21］.浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響較大。在采用農(nóng)桿菌介導法進行基因轉(zhuǎn)化時，外植體的材料來源及其生理狀態(tài)、感菌時間、菌液濃度、共培養(yǎng)時間、預培養(yǎng)時間等因素都會影響轉(zhuǎn)化效果。M P — WT 1 2 3 4 5 6 7 8圖32 轉(zhuǎn)GmftsH基因植株的PCR檢測M：DL5000；P：陽性質(zhì)粒對照；：ddH2O；WT:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 PCR analysis of transgenetic GmftsH plantsM：DNA Marker；P：PCR result of plasmid of pMDC83GmftsH；：ddH2O；WT:Wide type；18：Transgenic plantsWT1 WT2 1 2 3 4 5 6 7 8圖33 GmftsH轉(zhuǎn)基因煙草的RTPCR鑒定WT12:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 Identification of the GmftsH transgentic lines by RTPCRWT12:Wide type；18：Transgenic plants3 討論在煙草組織培養(yǎng)過程中，本試驗做預培養(yǎng)用的是營養(yǎng)缽育苗，不是直接用無菌苗在無菌操作臺上操作、培養(yǎng)箱培養(yǎng)，污染經(jīng)常發(fā)生。對PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株，提取總RNA樣品RTPCR分析以檢測GmftsH基因的轉(zhuǎn)錄情況。圖31葉盤法轉(zhuǎn)基因煙草流程圖 The vector was transformed into Nicotiana tabacum using the leafdisc protocal 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測為了檢測目的基因GmftsH的整合性，提取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA進行PCR檢測。為了確定合適的預培養(yǎng)時間，將葉片分別預培養(yǎng)0d、ld、3d、5d后在相同條件下感染及共培養(yǎng)，試驗結(jié)果如下表24預培養(yǎng)時間對抗性芽產(chǎn)生的影響預培養(yǎng)時間/天 0 1 3 5平均出抗性芽數(shù)/個 由實驗數(shù)據(jù)可知:當根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉外植體時預培養(yǎng)時間為3d，平均每個外植體出抗性芽數(shù)最多，轉(zhuǎn)化的效果最佳。而處在分裂狀態(tài)的細胞更易整合外源DNA。 預培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響一般認為，外植體的預培養(yǎng)可使傷口周圍的細胞得以恢復，如愈合過程中分泌的酚類物質(zhì)誘導農(nóng)桿菌Vir基因啟動。在既要考慮轉(zhuǎn)化率又要考慮污染率的情況下，感染3—5min最好。農(nóng)菌浸染時間為6—8min時，平均每個外植體的抗性芽雖然增多了一些，可能是因為感染的時間變長后，農(nóng)桿菌浸染植物細胞的幾率增大了，%。 侵染時間對轉(zhuǎn)化率的影響用農(nóng)桿菌LBA44O4菌液感染煙草葉外植體，在轉(zhuǎn)化方法相同的條件下改變農(nóng)桿菌浸染外植體的時間，分別以35min、68min、1012min來進行，比較其對污染率和轉(zhuǎn)化效率的影響。而濃度太低，雖然腐化率降低了，但是因感染的強度不夠，轉(zhuǎn)化的成功率會降低。表21農(nóng)桿菌菌液的稀釋倍數(shù)對抗性芽產(chǎn)生的影響菌液稀釋倍數(shù)/倍 接種外植體數(shù)/個 死亡率/%10 52 % 20 50 % 30 55 %
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