農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-閱讀頁
2025-07-13 13:49本頁面
【正文】 85℃ 5 sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA采用煙草內(nèi)參基因actin檢測質(zhì)量，并保存與20℃。 CCTCAACCCAAAGGTCAACAG3’內(nèi)參actin下游引物A2：539。引物序列采用GmftsH基因特異性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下劃線標(biāo)示為attB1位點)；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACATTG(下劃線標(biāo)示為attB2位點)；RTPCR反應(yīng)體系為25ul。%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。分別將菌液稀釋40倍，感染3mni后共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入含潮霉素 50mg/L及Carb mg/L的FI分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)［1820］。若稀釋低于30倍，農(nóng)桿菌濃度高，經(jīng)過一個星期左右的選擇培養(yǎng)后，潛伏的農(nóng)桿菌會大量繁殖，對葉片造成污染，致使葉片死亡。在既要求得到一定數(shù)量的存活外植體數(shù)又要保證一定的轉(zhuǎn)化率減輕后續(xù)的篩選工作的情況下，選用30倍的農(nóng)桿菌菌液稀釋濃度為宜。表22浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響感染時間/倍 污染率/% 平均出抗性芽數(shù)/個 35 68 1012 100 0(注:污染率=污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)平均出芽數(shù):指未被污染外植體的平均出芽數(shù))農(nóng)桿菌浸染時間為3—5min時，外植體污染少，轉(zhuǎn)化效率比較高。而當(dāng)浸染時間達(dá)到10—12min時，煙草葉外植體傷口變褐、腐化，最終由于農(nóng)桿菌生長過于旺盛，選擇培養(yǎng)基難以抑制其生長而使外植體全部被污染，完全不能轉(zhuǎn)化。 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響農(nóng)桿菌浸染植物后，其TDNA要轉(zhuǎn)移并整合到植物體內(nèi)需要一定的時間，所以，外植體感菌后還需在無抗生素的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)一段時間,將其時間設(shè)為0d、3d、5d:表23共培養(yǎng)時間對芽分化的影響共培養(yǎng)時間/天 污染率/% 平均出抗性芽數(shù)/個 0 0 3 5 由實驗結(jié)果可看出，共培養(yǎng)3d的芽分化率比0d的要高一些，因為在這種情況下，感菌時間長有利于農(nóng)桿菌的侵入，而共培養(yǎng)5d的外植體污染較嚴(yán)重，綜合外植體污染情況及出芽率高低得出最佳共培養(yǎng)時間為3d。預(yù)培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞分裂，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，減少傷害脅迫而有利于農(nóng)桿菌感染。在高滲培養(yǎng)基上進(jìn)行外植體預(yù)培養(yǎng)還可減少傷口處的細(xì)胞傷流液，使細(xì)胞內(nèi)的液泡減少并使細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的質(zhì)壁分離，使農(nóng)桿菌易于接觸傷口周圍的細(xì)胞。 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測（PCR、RTPCR） 轉(zhuǎn)基因植株的獲得將構(gòu)建好的植物過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，潮霉素初篩后得到組培轉(zhuǎn)化煙草苗，轉(zhuǎn)化流程如圖31。結(jié)果如圖32所示，轉(zhuǎn)基因植株中能夠擴(kuò)增出特異的條帶，選取3條陽性條帶測序，發(fā)現(xiàn)和克隆的目的基因序列一致，說明GmftsH基因已經(jīng)整合進(jìn)了煙草基因組中。結(jié)果如圖33所示，在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠擴(kuò)增出特異條帶，而在野生型煙草對照中沒有檢測到特異條帶，說明該基因在RNA水平上得到表達(dá)。另外，若工作環(huán)境空氣不清潔，超凈工作臺過濾裝置失效，培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底，外植體帶菌及操作違規(guī)等也都容易造成污染。苗齡對外植體再生能力的影響，是因為考慮到外植體的葉齡和生理狀況對轉(zhuǎn)化的影響較大，因為其再生能力不同對農(nóng)桿菌浸染的敏感性不同。當(dāng)外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡時間達(dá)到8一12min時，外植體全部被污染，完全不能被轉(zhuǎn)化。可見，掌握外植體在菌液中的浸泡時間，有助于減少后繼培養(yǎng)中可能造成的污染，并可減輕細(xì)菌對植物細(xì)胞的毒害作用。試驗時，曾以不稀釋的農(nóng)桿菌菌液來浸染外植體，結(jié)果經(jīng)未稀釋菌液浸染的外植體全部褐化死亡，無轉(zhuǎn)化芽生成。而在農(nóng)桿菌感染外植體后，傷口處的細(xì)胞會因過敏反應(yīng)而導(dǎo)致褐化，從而嚴(yán)重影響再生芽的分化頻率和轉(zhuǎn)化頻率。但共培養(yǎng)時間太長也不利于轉(zhuǎn)化，當(dāng)培養(yǎng)時間超過一周，農(nóng)桿菌的大量生長對葉外植體產(chǎn)生抑制，并且在隨后的培養(yǎng)過程中難以消除。預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化影響較小，實驗結(jié)果表明，無論是經(jīng)過3d的預(yù)培養(yǎng)的煙草葉盤，還是未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)而直接侵染的葉盤，其出抗性芽數(shù)沒有顯著的差別，所以為了縮短轉(zhuǎn)化時間，其實可以考慮省去預(yù)培養(yǎng)。PCR反應(yīng)涉及到的因素有很多，而且對每個因素的條件都極其敏感［22］。致謝：本研究工作是在導(dǎo)師XX教授精心指導(dǎo)下完成的。她耐心的指導(dǎo)、孜孜不倦的教誨、勤奮嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度將使學(xué)生終生受益。最后我要感謝我的家人和朋友，是他們在物質(zhì)和精神上給予我殷切的關(guān)懷和支持，才使我得以順利完成學(xué)業(yè)參考文
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