農(nóng)學院本科生-農(nóng)桿菌介導gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文(存儲版)
【正文】 GmftsH轉(zhuǎn)基因煙草的RTPCR鑒定WT12:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 Identification of the GmftsH transgentic lines by RTPCRWT12:Wide type；18：Transgenic plants3 討論在煙草組織培養(yǎng)過程中，本試驗做預培養(yǎng)用的是營養(yǎng)缽育苗，不是直接用無菌苗在無菌操作臺上操作、培養(yǎng)箱培養(yǎng)，污染經(jīng)常發(fā)生。同時農(nóng)桿菌菌液對外植體有一定的毒害作用，這可能與細菌過量分泌一些毒性物質(zhì)有關(guān)。本實驗煙草轉(zhuǎn)化植株的分子檢測采用PCR檢測，PCR是最常用的一種分子生物學檢測方法，具有材料用量少，檢測方便，適合于大批量樣品分析等優(yōu)點，是早期檢測的好方法。值此論文完成之際，謹向恩師表示我最誠摯的感謝 本論文的主要工作是在XX，感謝學校所提供的完善的實驗設備和實驗材料，同時要感謝此過程中，XX學長所給予我的精心指導和熱情幫助。本實驗比較了共培養(yǎng)0d、3d、5d的效果，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3d為最佳共培養(yǎng)時間為?？赡苁且驗樵诰褐薪輹r間太長，外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐。對PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株，提取總RNA樣品RTPCR分析以檢測GmftsH基因的轉(zhuǎn)錄情況。 預培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響一般認為，外植體的預培養(yǎng)可使傷口周圍的細胞得以恢復，如愈合過程中分泌的酚類物質(zhì)誘導農(nóng)桿菌Vir基因啟動。而濃度太低，雖然腐化率降低了，但是因感染的強度不夠，轉(zhuǎn)化的成功率會降低。GACCAGCGAGATCCAAACGAA3’ RTPCR檢測將反轉(zhuǎn)得到的cDNA進行RTPCR檢測。 cDNA的合成cDNA合成依據(jù)TaKaRa試劑公司SYBR174。（6）12000rpm離心10分鐘（4℃），樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。對于PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，下一步進行提取總RNA，進行cDNA的合成。（9）加入5μl RNase(10mg/ml), 37℃保溫30min。 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 轉(zhuǎn)基因煙草DNA的提取采用CTAB微量分離法提取煙草DNA（1）在50ml 離心管中加入20ml 2CTAB 提取緩沖液，65oC 預熱。(3) 無菌狀態(tài)下，將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)過4000rpm(4℃)離心10分鐘，棄去上清。121℃高壓滅菌鍋滅菌MS3（生根）：1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 。而FtsH基因廣泛分布于原核生物和真核生物中，其生物學功能也多種多樣。 本科生畢業(yè)論文（設計）題 目: 農(nóng)桿菌介導GmftsH基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化 姓 名: 學 院: 農(nóng)學院 專 業(yè): 農(nóng)學 班 級: 學 號: 指導教師: 職稱: 2011 年 5 月 15 日目 錄摘要 3關(guān)鍵詞 3Abstract 3Key Words 31 材料與方法 4 材料 4 植物材料 4 菌株和載體 5 培養(yǎng)基 5 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基 5 煙草組織培養(yǎng)基 5 主要試劑 5 方法 5 農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草 5 受體材料準備 5 農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 6 農(nóng)桿菌侵染外植體及培養(yǎng) 6 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 6 轉(zhuǎn)基因煙草DNA的提取 6 PCR鑒定 7 轉(zhuǎn)基因煙草RNA的提取 7 cDNA的合成 8 RTPCR檢測 82 結(jié)果與分析 9 影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的因素 9 菌液濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響 9 侵染時間對轉(zhuǎn)化率的影響 9 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響 10 預培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響 10 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測（PCR、RTPCR） 11 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 11 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測 113 討論 12致謝 13參考文獻 13農(nóng)桿菌介導GmftsH基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化摘要：利用農(nóng)桿菌介導的方法將GmftsH基因轉(zhuǎn)入三生煙煙草中，震蕩4～5分鐘，然后置于MS1固體培養(yǎng)基上，在25℃的組織室內(nèi)共培養(yǎng)2天，待再生幼苗根系發(fā)達后，將不定芽進行移栽從而獲得了三生煙煙草轉(zhuǎn)化植株。該實驗旨在建立農(nóng)桿菌介導的高效快速的煙草遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，為分子生物學和植物基因工程的研究提供較好的技術(shù)基礎。121℃高壓滅菌鍋滅菌MS2（選擇）：MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+頭孢50ug/ml 。(2) 以1%的接種量接種于100mlYEB液體培養(yǎng)基中（內(nèi)含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28℃，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600=）。(6) 注意觀察再生煙草的生長情況，注意澆水，開關(guān)燈等。（7）用4ml 75％乙醇洗滌沉淀2 次以除去鹽（置于20℃冰箱放置過夜）（8）倒去75％乙醇，37℃干燥(20min)，溶于600μl T
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