農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文(文件)
【正文】 次，最后用滅過菌的濾紙吸干多余水分；。(3) 無菌狀態(tài)下，將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)過4000rpm(4℃)離心10分鐘，棄去上清。(3) 選擇培養(yǎng) 待愈傷組織分化成苗后用解剖刀切去整株的小植株轉(zhuǎn)入裝有分化培養(yǎng)基MS2的培養(yǎng)罐中，繼續(xù)培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 轉(zhuǎn)基因煙草DNA的提取采用CTAB微量分離法提取煙草DNA（1）在50ml 離心管中加入20ml 2CTAB 提取緩沖液，65oC 預(yù)熱。（4）室溫下4，000rpm 離心10min，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。（9）加入5μl RNase(10mg/ml), 37℃保溫30min。 PCR鑒定用CTAB法提取得到的煙草基因組DNA為模板［1012］，用GmftsH基因特異性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下劃線標(biāo)示為attB1位點(diǎn))；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACATTG(下劃線標(biāo)示為attB2位點(diǎn))；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以野生型和ddH2O為陰性對照，含有目的基因的質(zhì)粒為陽性對照。對于PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，下一步進(jìn)行提取總RNA，進(jìn)行cDNA的合成。（2）80℃保存的大豆各組織材料放入小研缽中，加入液氮快速研磨至粉末，隨后立即加入1000ul的裂解液RZ，在研缽中充分研磨。（6）12000rpm離心10分鐘（4℃），樣品會(huì)分成三層：黃色的有機(jī)相，中間層和無色的水相，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。（9）向吸附柱CR中加入700ul的漂洗液RW，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉收集管中的廢液。 cDNA的合成cDNA合成依據(jù)TaKaRa試劑公司SYBR174。 Buffer 2μlPrimeScript174。GACCAGCGAGATCCAAACGAA3’ RTPCR檢測將反轉(zhuǎn)得到的cDNA進(jìn)行RTPCR檢測。2 結(jié)果與分析 影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的因素 菌液濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響在對農(nóng)桿菌菌液的稀釋過程中發(fā)現(xiàn)，菌液的濃度對葉片切口處芽誘導(dǎo)率有很大影響。而濃度太低，雖然腐化率降低了，但是因感染的強(qiáng)度不夠，轉(zhuǎn)化的成功率會(huì)降低。農(nóng)菌浸染時(shí)間為6—8min時(shí)，平均每個(gè)外植體的抗性芽雖然增多了一些，可能是因?yàn)楦腥镜臅r(shí)間變長后，農(nóng)桿菌浸染植物細(xì)胞的幾率增大了，%。 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響一般認(rèn)為，外植體的預(yù)培養(yǎng)可使傷口周圍的細(xì)胞得以恢復(fù)，如愈合過程中分泌的酚類物質(zhì)誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因啟動(dòng)。為了確定合適的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，將葉片分別預(yù)培養(yǎng)0d、ld、3d、5d后在相同條件下感染及共培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果如下表24預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對抗性芽產(chǎn)生的影響預(yù)培養(yǎng)時(shí)間/天 0 1 3 5平均出抗性芽數(shù)/個(gè) 由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知:當(dāng)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉外植體時(shí)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d，平均每個(gè)外植體出抗性芽數(shù)最多，轉(zhuǎn)化的效果最佳。對PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株，提取總RNA樣品RTPCR分析以檢測GmftsH基因的轉(zhuǎn)錄情況。在采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)，外植體的材料來源及其生理狀態(tài)、感菌時(shí)間、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等因素都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效果?？赡苁且?yàn)樵诰褐薪輹r(shí)間太長，外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐?？梢钥闯?，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度較高(僅稀釋10倍時(shí))，決大部分的葉外植體都腐化死亡掉，而當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度較低(稀釋30倍時(shí))，葉外植體都能存活并分化出芽。本實(shí)驗(yàn)比較了共培養(yǎng)0d、3d、5d的效果，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3d為最佳共培養(yǎng)時(shí)間為。其中模板的濃度和純度、Tqa酶、引物、dNTP、退火溫度對PCR反應(yīng)的影響尤其明顯，如果某個(gè)因素沒有掌握好，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶或產(chǎn)生的特異條帶較弱甚至消失，因此在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前，建立一個(gè)合適的反應(yīng)體系很重要。值此論文完成之際，謹(jǐn)向恩師表示我最誠摯的感謝 本論文的主要工作是在XX，感謝學(xué)校所提供的完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)要感謝此過程中，XX學(xué)長所給予我的精心指導(dǎo)和熱情幫助。從論文的選題、整個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施及論文的寫作全部過程中，導(dǎo)師傾注了大量的心血。本實(shí)驗(yàn)煙草轉(zhuǎn)化植株的分子檢測采用PCR檢測，PCR是最常用的一種分子生物學(xué)檢測方法，具有材料用量少，檢測方便，適合于大批量樣品分析等優(yōu)點(diǎn)，是早期檢測的好方法。而卡那霉素加入時(shí)間對轉(zhuǎn)化作用影響很大，如果把感染后的外植體馬上轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，細(xì)胞很難在含有高濃度的卡那霉素上存活并誘導(dǎo)成芽。同時(shí)農(nóng)桿菌菌液對外植體有一定的毒害作用，這可能與細(xì)菌過量分泌一些毒性物質(zhì)有關(guān)。另外，分生組織及伴有活躍細(xì)胞分裂的外植體對農(nóng)桿菌的浸染最為敏感，故一般認(rèn)為幼嫩的外植體比老的外植體好［21］.浸染時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響較大。M P — WT 1 2 3 4 5 6 7 8圖32 轉(zhuǎn)GmftsH基因植株的PCR檢測M：DL5000；P：陽性質(zhì)粒對照；：ddH2O；WT:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 PCR analysis of transgenetic GmftsH plantsM：DNA
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