農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-全文預(yù)覽
【正文】 Marker；P：PCR result of plasmid of pMDC83GmftsH；：ddH2O；WT:Wide type；18：Transgenic plantsWT1 WT2 1 2 3 4 5 6 7 8圖33 GmftsH轉(zhuǎn)基因煙草的RTPCR鑒定WT12:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 Identification of the GmftsH transgentic lines by RTPCRWT12:Wide type；18：Transgenic plants3 討論在煙草組織培養(yǎng)過(guò)程中，本試驗(yàn)做預(yù)培養(yǎng)用的是營(yíng)養(yǎng)缽育苗，不是直接用無(wú)菌苗在無(wú)菌操作臺(tái)上操作、培養(yǎng)箱培養(yǎng)，污染經(jīng)常發(fā)生。圖31葉盤(pán)法轉(zhuǎn)基因煙草流程圖 The vector was transformed into Nicotiana tabacum using the leafdisc protocal 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)為了檢測(cè)目的基因GmftsH的整合性，提取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。而處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA。在既要考慮轉(zhuǎn)化率又要考慮污染率的情況下，感染3—5min最好。 侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響用農(nóng)桿菌LBA44O4菌液感染煙草葉外植體，在轉(zhuǎn)化方法相同的條件下改變農(nóng)桿菌浸染外植體的時(shí)間，分別以35min、68min、1012min來(lái)進(jìn)行，比較其對(duì)污染率和轉(zhuǎn)化效率的影響。表21農(nóng)桿菌菌液的稀釋倍數(shù)對(duì)抗性芽產(chǎn)生的影響菌液稀釋倍數(shù)/倍 接種外植體數(shù)/個(gè) 死亡率/%10 52 % 20 50 % 30 55 % 40 48 0實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明稀釋30倍的農(nóng)桿菌所介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的葉片，分化出抗性芽的機(jī)率大。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。內(nèi)參actin上游引物A1：539。 RTPCR Kit II試劑盒中cDNA合成產(chǎn)品TaKaRa Code：DRR037A操作說(shuō)明。（11）將吸附柱CR轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入3050ul的RNasefree ddH2O，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘（4℃）。（7），混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。（4）12000rpm離心5分鐘（4℃），取上清，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無(wú)RNase的離心管中。 轉(zhuǎn)基因煙草RNA的提?。?）采用天跟時(shí)代（TIANGEN）公司的Total RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA用的槍頭、%的DEPC溶液12個(gè)小時(shí)以上，隨后取出高壓滅菌。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。（12）上清液中加入1/10 體積4M NaCl 溶液后，加入2 倍體積無(wú)水乙醇，室溫放置20min 后，10，000rpm 離心5min，沉淀DNA。（6）離心去上清液(8，000rpm, 10min，室溫)。（3）于65℃，并且加上40μl 巰基乙醇，中間溫和的混合幾次。(5) 待再生幼苗根系發(fā)達(dá)后，開(kāi)蓋培養(yǎng)23天強(qiáng)化整株后，取出植株用無(wú)菌水清洗掉幼苗根部的瓊脂再移栽到滅菌土的盆缽中放置于室溫中培養(yǎng)。 農(nóng)桿菌侵染外植體及培養(yǎng)(1) 侵染 將外植體放入上述（5）的菌懸液中，震蕩45分鐘，使農(nóng)桿菌與外植體傷口部位充分接觸，將外植體從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS1固體培養(yǎng)基上（葉片光滑面朝上），用封口膜封好后，在25℃的組培室共培養(yǎng)2天。 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)(1) 挑取含有目的基因的單克隆，接種于YEB培養(yǎng)基上活化，單菌落接種于2ml的YEB液體培養(yǎng)基中（內(nèi)含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28℃，200rpm振蕩過(guò)夜。0)（4）氯仿:異戊醇：按體積比24:1混合平衡氯仿和異戊醇，放于棕色試劑瓶中，4℃保存。121℃高壓滅菌鍋滅菌 煙草組織培養(yǎng)基MS1（共培養(yǎng)）：。1 材料與方法 材料 植物材料煙草三生煙種子，將野生型煙草種子種植在營(yíng)養(yǎng)土中，25℃條件下培養(yǎng)4060天左右。近年來(lái)，這種純生物的方法由于具有轉(zhuǎn)化率高，可導(dǎo)入大片段DNA，且導(dǎo)入基因的拷貝數(shù)低，表達(dá)效果好，儀器和操作技術(shù)較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，引起了人們的極大關(guān)注［2］。最后通過(guò)RTPCR反應(yīng)進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株GmftsH基因在轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠擴(kuò)增出特異條帶，而在野生型煙草對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到特異條帶，說(shuō)明該基因在RNA水平上得到表達(dá)。再經(jīng)PCR檢測(cè)，為陽(yáng)性的植株均能擴(kuò)增出與目的片斷大小一致的特異性條帶，初步表明GmftsH基因已經(jīng)轉(zhuǎn)到這些煙草
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