農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-資料下載頁(yè)
2025-06-28 13:49本頁(yè)面
【正文】 由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知:當(dāng)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉外植體時(shí)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d，平均每個(gè)外植體出抗性芽數(shù)最多，轉(zhuǎn)化的效果最佳。 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測(cè)（PCR、RTPCR） 轉(zhuǎn)基因植株的獲得將構(gòu)建好的植物過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，潮霉素初篩后得到組培轉(zhuǎn)化煙草苗，轉(zhuǎn)化流程如圖31。圖31葉盤法轉(zhuǎn)基因煙草流程圖 The vector was transformed into Nicotiana tabacum using the leafdisc protocal 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)為了檢測(cè)目的基因GmftsH的整合性，提取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖32所示，轉(zhuǎn)基因植株中能夠擴(kuò)增出特異的條帶，選取3條陽(yáng)性條帶測(cè)序，發(fā)現(xiàn)和克隆的目的基因序列一致，說(shuō)明GmftsH基因已經(jīng)整合進(jìn)了煙草基因組中。對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，提取總RNA樣品RTPCR分析以檢測(cè)GmftsH基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果如圖33所示，在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠擴(kuò)增出特異條帶，而在野生型煙草對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到特異條帶，說(shuō)明該基因在RNA水平上得到表達(dá)。M P — WT 1 2 3 4 5 6 7 8圖32 轉(zhuǎn)GmftsH基因植株的PCR檢測(cè)M：DL5000；P：陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；：ddH2O；WT:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 PCR analysis of transgenetic GmftsH plantsM：DNA Marker；P：PCR result of plasmid of pMDC83GmftsH；：ddH2O；WT:Wide type；18：Transgenic plantsWT1 WT2 1 2 3 4 5 6 7 8圖33 GmftsH轉(zhuǎn)基因煙草的RTPCR鑒定WT12:野生型；18：轉(zhuǎn)基因植株 Identification of the GmftsH transgentic lines by RTPCRWT12:Wide type；18：Transgenic plants3 討論在煙草組織培養(yǎng)過(guò)程中，本試驗(yàn)做預(yù)培養(yǎng)用的是營(yíng)養(yǎng)缽育苗，不是直接用無(wú)菌苗在無(wú)菌操作臺(tái)上操作、培養(yǎng)箱培養(yǎng)，污染經(jīng)常發(fā)生。另外，若工作環(huán)境空氣不清潔，超凈工作臺(tái)過(guò)濾裝置失效，培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底，外植體帶菌及操作違規(guī)等也都容易造成污染。在采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)，外植體的材料來(lái)源及其生理狀態(tài)、感菌時(shí)間、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等因素都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效果。苗齡對(duì)外植體再生能力的影響，是因?yàn)榭紤]到外植體的葉齡和生理狀況對(duì)轉(zhuǎn)化的影響較大，因?yàn)槠湓偕芰Σ煌瑢?duì)農(nóng)桿菌浸染的敏感性不同。另外，分生組織及伴有活躍細(xì)胞分裂的外植體對(duì)農(nóng)桿菌的浸染最為敏感，故一般認(rèn)為幼嫩的外植體比老的外植體好［21］.浸染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響較大。當(dāng)外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡時(shí)間達(dá)到8一12min時(shí)，外植體全部被污染，完全不能被轉(zhuǎn)化?？赡苁且?yàn)樵诰褐薪輹r(shí)間太長(zhǎng)，外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐?？梢姡莆胀庵搀w在菌液中的浸泡時(shí)間，有助于減少后繼培養(yǎng)中可能造成的污染，并可減輕細(xì)菌對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用。同時(shí)農(nóng)桿菌菌液對(duì)外植體有一定的毒害作用，這可能與細(xì)菌過(guò)量分泌一些毒性物質(zhì)有關(guān)。試驗(yàn)時(shí)，曾以不稀釋的農(nóng)桿菌菌液來(lái)浸染外植體，結(jié)果經(jīng)未稀釋菌液浸染的外植體全部褐化死亡，無(wú)轉(zhuǎn)化芽生成。可以看出，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度較高(僅稀釋10倍時(shí))，決大部分的葉外植體都腐化死亡掉，而當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度較低(稀釋30倍時(shí))，葉外植體都能存活并分化出芽。而在農(nóng)桿菌感染外植體后，傷口處的細(xì)胞會(huì)因過(guò)敏反應(yīng)而導(dǎo)致褐化，從而嚴(yán)重影響再生芽的分化頻率和轉(zhuǎn)化頻率。而卡那霉素加入時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化作用影響很大，如果把感染后的外植體馬上轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，細(xì)胞很難在含有高濃度的卡那霉素上存活并誘導(dǎo)成芽。但共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)也不利于轉(zhuǎn)化，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)一周，農(nóng)桿菌的大量生長(zhǎng)對(duì)葉外植體產(chǎn)生抑制，并且在隨后的培養(yǎng)過(guò)程中難以消除。本實(shí)驗(yàn)比較了共培養(yǎng)0d、3d、5d的效果，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3d為最佳共培養(yǎng)時(shí)間為。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化影響較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是經(jīng)過(guò)3d的預(yù)培養(yǎng)的煙草葉盤，還是未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)而直接侵染的葉盤，其出抗性芽數(shù)沒(méi)有顯著的差別，所以為了縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，其實(shí)可以考慮省去預(yù)培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)煙草轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)采用PCR檢測(cè)，PCR是最常用的一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，具有材料用量少，檢測(cè)方便，適合于大批量樣品分析等優(yōu)點(diǎn)，是早期檢測(cè)的好方法。PCR反應(yīng)涉及到的因素有很多，而且對(duì)每個(gè)因素的條件都極其敏感［22］。其中模板的濃度和純度、Tqa酶、引物、dNTP、退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響尤其明顯，如果某個(gè)因素沒(méi)有掌握好，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶或產(chǎn)生的特異條帶較弱甚至消失，因此在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前，建立一個(gè)合適的反應(yīng)體系很重要。致謝：本研究工作是在導(dǎo)師XX教授精心指導(dǎo)下完成的。從論文的選題、整個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施及論文的寫作全部過(guò)程中，導(dǎo)師傾注了大量的心血。她耐心的指導(dǎo)、孜孜不倦的教誨、勤奮嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度將使學(xué)生終生受益。值此論文完成之際，謹(jǐn)向恩師表示我最誠(chéng)摯的感謝 本論文的主要工作是在XX，感謝學(xué)校所提供的完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)要感謝此過(guò)程中，XX學(xué)長(zhǎng)所給予我的精心指導(dǎo)和熱情幫助。最后我要感謝我的家人和朋友，是他們?cè)谖镔|(zhì)和精神上給予我殷切的關(guān)懷和支持，才使我得以順利完成學(xué)業(yè)參考文
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