農學院本科生-農桿菌介導gmftsh基因的煙草遺傳轉化畢業(yè)論文-資料下載頁
2025-06-28 13:49本頁面
【正文】 由實驗數(shù)據(jù)可知:當根癌農桿菌轉化煙草葉外植體時預培養(yǎng)時間為3d，平均每個外植體出抗性芽數(shù)最多，轉化的效果最佳。 轉基因植株的獲得及分子檢測（PCR、RTPCR） 轉基因植株的獲得將構建好的植物過表達載體轉化農桿菌，通過農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，潮霉素初篩后得到組培轉化煙草苗，轉化流程如圖31。圖31葉盤法轉基因煙草流程圖 The vector was transformed into Nicotiana tabacum using the leafdisc protocal 轉基因植株的分子檢測為了檢測目的基因GmftsH的整合性，提取轉基因煙草和野生型煙草的基因組DNA進行PCR檢測。結果如圖32所示，轉基因植株中能夠擴增出特異的條帶，選取3條陽性條帶測序，發(fā)現(xiàn)和克隆的目的基因序列一致，說明GmftsH基因已經整合進了煙草基因組中。對PCR檢測呈陽性的轉基因植株，提取總RNA樣品RTPCR分析以檢測GmftsH基因的轉錄情況。結果如圖33所示，在轉基因煙草中能夠擴增出特異條帶，而在野生型煙草對照中沒有檢測到特異條帶，說明該基因在RNA水平上得到表達。M P — WT 1 2 3 4 5 6 7 8圖32 轉GmftsH基因植株的PCR檢測M：DL5000；P：陽性質粒對照；：ddH2O；WT:野生型；18：轉基因植株 PCR analysis of transgenetic GmftsH plantsM：DNA Marker；P：PCR result of plasmid of pMDC83GmftsH；：ddH2O；WT:Wide type；18：Transgenic plantsWT1 WT2 1 2 3 4 5 6 7 8圖33 GmftsH轉基因煙草的RTPCR鑒定WT12:野生型；18：轉基因植株 Identification of the GmftsH transgentic lines by RTPCRWT12:Wide type；18：Transgenic plants3 討論在煙草組織培養(yǎng)過程中，本試驗做預培養(yǎng)用的是營養(yǎng)缽育苗，不是直接用無菌苗在無菌操作臺上操作、培養(yǎng)箱培養(yǎng)，污染經常發(fā)生。另外，若工作環(huán)境空氣不清潔，超凈工作臺過濾裝置失效，培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底，外植體帶菌及操作違規(guī)等也都容易造成污染。在采用農桿菌介導法進行基因轉化時，外植體的材料來源及其生理狀態(tài)、感菌時間、菌液濃度、共培養(yǎng)時間、預培養(yǎng)時間等因素都會影響轉化效果。苗齡對外植體再生能力的影響，是因為考慮到外植體的葉齡和生理狀況對轉化的影響較大，因為其再生能力不同對農桿菌浸染的敏感性不同。另外，分生組織及伴有活躍細胞分裂的外植體對農桿菌的浸染最為敏感，故一般認為幼嫩的外植體比老的外植體好［21］.浸染時間對轉化效率的影響較大。當外植體在農桿菌菌液中浸泡時間達到8一12min時，外植體全部被污染，完全不能被轉化?？赡苁且驗樵诰褐薪輹r間太長，外植體因農桿菌毒害缺氧而軟腐。可見，掌握外植體在菌液中的浸泡時間，有助于減少后繼培養(yǎng)中可能造成的污染，并可減輕細菌對植物細胞的毒害作用。同時農桿菌菌液對外植體有一定的毒害作用，這可能與細菌過量分泌一些毒性物質有關。試驗時，曾以不稀釋的農桿菌菌液來浸染外植體，結果經未稀釋菌液浸染的外植體全部褐化死亡，無轉化芽生成。可以看出，當農桿菌菌液濃度較高(僅稀釋10倍時)，決大部分的葉外植體都腐化死亡掉，而當農桿菌菌液濃度較低(稀釋30倍時)，葉外植體都能存活并分化出芽。而在農桿菌感染外植體后，傷口處的細胞會因過敏反應而導致褐化，從而嚴重影響再生芽的分化頻率和轉化頻率。而卡那霉素加入時間對轉化作用影響很大，如果把感染后的外植體馬上轉移到含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，細胞很難在含有高濃度的卡那霉素上存活并誘導成芽。但共培養(yǎng)時間太長也不利于轉化，當培養(yǎng)時間超過一周，農桿菌的大量生長對葉外植體產生抑制，并且在隨后的培養(yǎng)過程中難以消除。本實驗比較了共培養(yǎng)0d、3d、5d的效果，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3d為最佳共培養(yǎng)時間為。預培養(yǎng)時間對轉化影響較小，實驗結果表明，無論是經過3d的預培養(yǎng)的煙草葉盤，還是未經過預培養(yǎng)而直接侵染的葉盤，其出抗性芽數(shù)沒有顯著的差別，所以為了縮短轉化時間，其實可以考慮省去預培養(yǎng)。本實驗煙草轉化植株的分子檢測采用PCR檢測，PCR是最常用的一種分子生物學檢測方法，具有材料用量少，檢測方便，適合于大批量樣品分析等優(yōu)點，是早期檢測的好方法。PCR反應涉及到的因素有很多，而且對每個因素的條件都極其敏感［22］。其中模板的濃度和純度、Tqa酶、引物、dNTP、退火溫度對PCR反應的影響尤其明顯，如果某個因素沒有掌握好，會導致產生非特異性條帶或產生的特異條帶較弱甚至消失，因此在進行PCR擴增之前，建立一個合適的反應體系很重要。致謝：本研究工作是在導師XX教授精心指導下完成的。從論文的選題、整個實驗的實施及論文的寫作全部過程中，導師傾注了大量的心血。她耐心的指導、孜孜不倦的教誨、勤奮嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度將使學生終生受益。值此論文完成之際，謹向恩師表示我最誠摯的感謝 本論文的主要工作是在XX，感謝學校所提供的完善的實驗設備和實驗材料，同時要感謝此過程中，XX學長所給予我的精心指導和熱情幫助。最后我要感謝我的家人和朋友，是他們在物質和精神上給予我殷切的關懷和支持，才使我得以順利完成學業(yè)參考文
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