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農(nóng)學院本科生-農(nóng)桿菌介導gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-在線瀏覽

2024-08-08 13:49本頁面
  

【正文】 。FtsH基因與熱激、高滲、光脅迫、冷誘導、病害等逆境脅迫有著不可分割的聯(lián)系[38],說明FtsH參與脅迫反應(yīng),但其確切的作用機制還不清楚,所以利用農(nóng)桿菌介導的方法先將FtsH基因成功轉(zhuǎn)入煙草中,可對FstH基因在煙草中的表達特性和生理功能的驗證做良好的實驗基礎(chǔ),為下一步的外源基因的遺傳穩(wěn)定性的檢測也做了鋪墊。 菌株和載體本研究采用根癌農(nóng)桿菌(EHA105)菌株為本實驗室保存。 培養(yǎng)基 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB培養(yǎng)基:酵母提取物(5g/l)+蔗糖(5g/l)+蛋白胨(5g/l)+七水硫酸鎂()+瓊脂(15g/l)。121℃高壓滅菌鍋滅菌MS2(選擇):MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+頭孢50ug/ml 。121℃高壓滅菌鍋滅菌 主要試劑(1)植物生長激素:6BA 200ug/ml,IAA (2)抗生素:Hyg 50ug/ml,Kan 50mg/L,Rif 25mg/L,頭孢霉素50ug/ml(3)TE緩沖液(pH=):1ommol/LtrisCl(PH=) lmmol/LEDTA(pH=8(5)電泳緩沖液TAE(50):每升含:242克Tris堿;;(PH=)(使用緩沖液為1ATE)(6)植物總DNA提取試劑(2XCTAB,pH=):每升含:;;;20克CTAB 方法 農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草 受體材料準備野生型煙草“三生煙”播種到營養(yǎng)土中,25℃培養(yǎng)4060天左右。注意:要保持葉片新鮮平整,切取外植體盡量避開葉脈[9]。(2) 以1%的接種量接種于100mlYEB液體培養(yǎng)基中(內(nèi)含Kan 50mg/L,Rif 25mg/L,Hyg 50mg/L),28℃,振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=)。(4) 用20ml的MS1液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀,4000rpm(4℃)離心10分鐘,棄去上清(5) 用20ml的MS1液體培養(yǎng)基再次重懸菌體沉淀,然后冰上放置,準備侵染野生型煙草的外植體之用。(2) 共培養(yǎng) 將MS1培養(yǎng)基上的外植體轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MS2上(MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+頭孢霉素),25℃光周期16h/18h,培養(yǎng)23周,其間每隔5天換一次分化培養(yǎng)基MS2,轉(zhuǎn)接過程中注意要將葉片邊緣侵入到分化培養(yǎng)基中,以便外植體吸收營養(yǎng),而且轉(zhuǎn)接當中要一直按照開始時轉(zhuǎn)接的方式把葉片的光滑面朝上。(4) 生根培養(yǎng) 植株長大后,切去多余的愈傷保留整株的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中MS3(1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA ),讓其生根。(6) 注意觀察再生煙草的生長情況,注意澆水,開關(guān)燈等。(2)取3~4g 新鮮的葉片,去掉主脈,在液氮中迅速研磨成均勻的粉末以后,把粉末倒入含有CTAB 緩沖液的離心管中,邊加邊攪拌均勻。時間到后取出并冷卻到室溫,加入等體積(20ml)的氯仿:異戊醇(24:1),顛倒混勻10min(輕緩)。(5)上清液中加入2/3 體積的異丙醇(2030ml),輕緩顛倒混和均勻,室溫放1020min。(7)用4ml 75%乙醇洗滌沉淀2 次以除去鹽(置于20℃冰箱放置過夜)(8)倒去75%乙醇,37℃干燥(20min),溶于600μl TE buffer,轉(zhuǎn)移至eppendorf管。(10)用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提1~3 次(視材料而定)(11)室溫4,000rpm 離心10min,吸上清。(13)沉淀用75%乙醇洗滌2~3 次,干燥后溶入適量的TE buffer(50μl)中備用。PCR反應(yīng)體系20ul:Buffer(Mg2+)2ul,dNTP ,Taq ,上、模板DNA 1ul,最后用ddH2O補足至20ul。%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。最后通過RTPCR反應(yīng)進行陽性轉(zhuǎn)基因植株GmftsH基因在轉(zhuǎn)錄水平的檢測[1317]。開始提取Total RNA之前,實驗所用的鑷子、小鑰匙及研缽等均需在酒精中灼燒30分鐘左右。(3)取出研磨好的勻漿液,1530℃放置5分鐘,使得核酸蛋白復合物完全分離。 (5)加入200ul的氯仿,蓋好管蓋,劇烈震蕩15秒,室溫放置3分鐘。把水相轉(zhuǎn)移到新管中,進行下一步操作。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR中,12000rpm離心30秒(4℃),倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CR放回收集管中。(10)將吸附柱CR放入2ml收集管中,12000rpm離心30秒(4℃),倒掉廢液。(12)將提取好的RNA進行電泳檢測后放80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?PrimeScript174。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表21表11 反轉(zhuǎn)錄體系試劑 使用量5PrimeScript174。 RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer Random 6 mers Total RNA 2ulRNase Free ddH2O up to 10μl 反轉(zhuǎn)錄程序:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))
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