農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-在線瀏覽
2024-08-08 13:49本頁(yè)面
【正文】 。FtsH基因與熱激、高滲、光脅迫、冷誘導(dǎo)、病害等逆境脅迫有著不可分割的聯(lián)系［38］，說(shuō)明FtsH參與脅迫反應(yīng)，但其確切的作用機(jī)制還不清楚，所以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法先將FtsH基因成功轉(zhuǎn)入煙草中，可對(duì)FstH基因在煙草中的表達(dá)特性和生理功能的驗(yàn)證做良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為下一步的外源基因的遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)也做了鋪墊。 菌株和載體本研究采用根癌農(nóng)桿菌（EHA105）菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。 培養(yǎng)基 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB培養(yǎng)基：酵母提取物（5g/l）+蔗糖（5g/l）+蛋白胨（5g/l）+七水硫酸鎂（）+瓊脂（15g/l）。121℃高壓滅菌鍋滅菌MS2（選擇）：MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+頭孢50ug/ml 。121℃高壓滅菌鍋滅菌 主要試劑（1）植物生長(zhǎng)激素：6BA 200ug/ml，IAA （2）抗生素：Hyg 50ug/ml，Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，頭孢霉素50ug/ml（3）TE緩沖液(pH=)：1ommol/LtrisCl(PH=) lmmol/LEDTA(pH=8（5）電泳緩沖液TAE（50）：每升含:242克Tris堿；；(PH=)(使用緩沖液為1ATE)（6）植物總DNA提取試劑(2XCTAB，pH=)：每升含：；；；20克CTAB 方法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草 受體材料準(zhǔn)備野生型煙草“三生煙”播種到營(yíng)養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)4060天左右。注意：要保持葉片新鮮平整，切取外植體盡量避開(kāi)葉脈［9］。(2) 以1%的接種量接種于100mlYEB液體培養(yǎng)基中（內(nèi)含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28℃，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=）。(4) 用20ml的MS1液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，4000rpm(4℃)離心10分鐘，棄去上清(5) 用20ml的MS1液體培養(yǎng)基再次重懸菌體沉淀，然后冰上放置，準(zhǔn)備侵染野生型煙草的外植體之用。(2) 共培養(yǎng) 將MS1培養(yǎng)基上的外植體轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MS2上（MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+頭孢霉素），25℃光周期16h/18h，培養(yǎng)23周，其間每隔5天換一次分化培養(yǎng)基MS2，轉(zhuǎn)接過(guò)程中注意要將葉片邊緣侵入到分化培養(yǎng)基中，以便外植體吸收營(yíng)養(yǎng)，而且轉(zhuǎn)接當(dāng)中要一直按照開(kāi)始時(shí)轉(zhuǎn)接的方式把葉片的光滑面朝上。(4) 生根培養(yǎng) 植株長(zhǎng)大后，切去多余的愈傷保留整株的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中MS3（1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA ），讓其生根。(6) 注意觀察再生煙草的生長(zhǎng)情況，注意澆水，開(kāi)關(guān)燈等。（2）取3～4g 新鮮的葉片，去掉主脈，在液氮中迅速研磨成均勻的粉末以后，把粉末倒入含有CTAB 緩沖液的離心管中，邊加邊攪拌均勻。時(shí)間到后取出并冷卻到室溫，加入等體積(20ml)的氯仿：異戊醇(24:1)，顛倒混勻10min（輕緩）。（5）上清液中加入2/3 體積的異丙醇(2030ml)，輕緩顛倒混和均勻，室溫放1020min。（7）用4ml 75％乙醇洗滌沉淀2 次以除去鹽（置于20℃冰箱放置過(guò)夜）（8）倒去75％乙醇，37℃干燥(20min)，溶于600μl TE buffer，轉(zhuǎn)移至eppendorf管。（10）用等體積氯仿：異戊醇(24:1)抽提1～3 次（視材料而定）（11）室溫4，000rpm 離心10min，吸上清。（13）沉淀用75％乙醇洗滌2～3 次，干燥后溶入適量的TE buffer(50μl)中備用。PCR反應(yīng)體系20ul：Buffer(Mg2+)2ul，dNTP ，Taq ，上、模板DNA 1ul，最后用ddH2O補(bǔ)足至20ul。%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。最后通過(guò)RTPCR反應(yīng)進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株GmftsH基因在轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)［1317］。開(kāi)始提取Total RNA之前，實(shí)驗(yàn)所用的鑷子、小鑰匙及研缽等均需在酒精中灼燒30分鐘左右。（3）取出研磨好的勻漿液，1530℃放置5分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 （5）加入200ul的氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15秒，室溫放置3分鐘。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR中，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。（10）將吸附柱CR放入2ml收集管中，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉廢液。（12）將提取好的RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)后放80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?PrimeScript174。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表21表11 反轉(zhuǎn)錄體系試劑 使用量5PrimeScript174。 RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer Random 6 mers Total RNA 2ulRNase Free ddH2O up to 10μl 反轉(zhuǎn)錄程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）
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