轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要技術(shù)及其應(yīng)用研究(編輯修改稿)
2025-07-25 06:21 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 可以用比cDNA測(cè)序更低的費(fèi)用而得到等量的信息，因此EST技術(shù)已成為目前發(fā)現(xiàn)新基因的強(qiáng)有力的信息工具。 原理和方法 一個(gè)典型的真核生物mRNA分子由5’UTR (5’ 端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū))、ORF (開(kāi)放閱讀框架)、3’UTR (3’ 端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū))和poly (A )四部分組成，其cDNA具有對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)。對(duì)于任何一個(gè)基因， 其5’UTR 和3’U TR都是特定的，即每條cDNA的5’端或3’端的有限序列可特異性地代表生物體某種組織在特定的時(shí)空條件下的一個(gè)表達(dá)基因。來(lái)自某一組織的足夠數(shù)量的ESTs可代表某種組織中基因的表達(dá)情況[ 1 ]。EST的數(shù)目可以反映某個(gè)基因的表達(dá)情況，一個(gè)基因的拷貝數(shù)越多，其表達(dá)越豐富，測(cè)得的相應(yīng)EST 就越多。所以，通過(guò)對(duì)生物體EST的分析可以獲得生物體內(nèi)基因的表達(dá)情況和表達(dá)豐度。要獲得生物體EST信息，通常應(yīng)先構(gòu)建其某個(gè)代表性組織的cDNA文庫(kù)，然后從中隨機(jī)挑取大量克隆，根據(jù)載體的通用引物進(jìn)行測(cè)序，一般可以得到其5’或3’端的200500 bp的堿基序列，然后將測(cè)得的EST序列與網(wǎng)上已有的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，根據(jù)同源性大小，可以初步鑒定出哪些EST 代表已知基因，哪些EST代表未知基因，并可以對(duì)生物體基因的表達(dá)豐度進(jìn)行分析。以EST 分析基因表達(dá)豐度的原理是這樣的：基因x的高水平表達(dá)將導(dǎo)致高水平的mRNAx合成，而與mRNA x相對(duì)應(yīng)的cDNA在cDNA文庫(kù)中的含量也會(huì)很豐富。所以，在對(duì)cDNA 文庫(kù)中的大量克隆進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序后，統(tǒng)計(jì)與基因x的mRNA相對(duì)應(yīng)的EST數(shù)目，就可估計(jì)原先mRNA群體中的mRNA x的豐度。而且，以與mRNA x相對(duì)應(yīng)的EST 數(shù)目除以所得到的EST 總數(shù)，就可得到mRNA x 絕對(duì)豐度的估計(jì)值。White等人稱(chēng)這種以cDNA 測(cè)序來(lái)估計(jì)基因表達(dá)水平的方法為“電子Northern”(electronic Northern) 或“數(shù)字Northern”(digital Northern)。EST構(gòu)建的技術(shù)路線為：提取樣品的總RNA 或帶有polyA的mRNA →構(gòu)建cDNA文庫(kù)，隨機(jī)挑取大量克隆進(jìn)行→EST測(cè)序→對(duì)測(cè)得的EST序列進(jìn)行組裝、拼接→對(duì)網(wǎng)上己有的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較→確定EST代表的是己知基因還是未知基因→對(duì)基因進(jìn)行定位、結(jié)構(gòu)、功能檢測(cè)分析。 應(yīng)用（1）基因組物理圖譜的繪制通過(guò)已知的EST序列設(shè)計(jì)引物對(duì)基因組BAC文庫(kù)進(jìn)行PCR能產(chǎn)生擴(kuò)增條帶的那個(gè)克隆就是EST在染色體上的位置，這個(gè)EST就可以被定位在幾號(hào)染色體上，進(jìn)而亞定位至染色體的某個(gè)區(qū)段。另外也可以用EST序列提供的探針與基因組BAC文庫(kù)雜交，同樣能將某個(gè)已知EST在染色體上定位和亞定位。EST與STS（特定序列位點(diǎn)）在基因組作圖上有相同的作用，而且EST位點(diǎn)還直接與一個(gè)表達(dá)的基因位置相對(duì)應(yīng)。（2）基因的電子克隆電子克隆技術(shù)是以算法為核心，以計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)為工具，利用現(xiàn)有的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST ) 和生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其中大量EST進(jìn)行分類(lèi)、整合、組裝,直接獲得大片段或cDNA 全長(zhǎng)的方法。由于EST 序列是全世界很多實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)產(chǎn)生的，所以屬于同起來(lái), 通過(guò)EST assembly 程序在EST 庫(kù)中搜索與之高度重疊的EST ，并將它們組裝成一致序列(consensus sequence) ，再用它檢索數(shù)據(jù)庫(kù)并逐次放寬匹配條件，重復(fù)組裝以獲得盡可能長(zhǎng)的或全長(zhǎng)cDNA 序列。電子克隆技術(shù)的出現(xiàn)，可充分利用現(xiàn)有的信息資源，別是利用其它模式生物的EST信息，快速發(fā)現(xiàn)有用基因。但該技術(shù)也有局限，如果參數(shù)限制條件太低，很可能會(huì)得到錯(cuò)誤結(jié)果；而參數(shù)條件限制太高，就可能沒(méi)有結(jié)果。對(duì)于所拼接出來(lái)的基因還需要從生物學(xué)意義上進(jìn)行分離和鑒定。（3）分離鑒定新基因?qū)δ骋惶禺惤M織或某一生長(zhǎng)發(fā)育階段的cDNA文庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)的部分測(cè)序，得到大量EST，將這些EST作查詢項(xiàng)在dbEST中進(jìn)行同源查找，同時(shí)將由EST推出的氨基酸序列作為查詢項(xiàng)在PIR中查找類(lèi)似物，很就可以識(shí)別這些基因到底是什么基因；對(duì)于那些在以上數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到類(lèi)似物的EST，再把它們置于6個(gè)ORF下，翻譯出推定的氨基酸序列，將可能的氨基酸序列作為查詢項(xiàng)，在PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中查找類(lèi)似物，果有類(lèi)似物，就認(rèn)為這個(gè)EST代表著這個(gè)蛋白的基因。對(duì)于通過(guò)EST數(shù)據(jù)庫(kù)和PIR數(shù)據(jù)庫(kù)已識(shí)別的EST，還可以通過(guò)探針雜交從cDNA文庫(kù)中分離我們所感興趣的那個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆。對(duì)于那些在dbEST和PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中都沒(méi)有類(lèi)似物的EST，就可能是完全新的基因，需要進(jìn)一步識(shí)別和研究它。(4) 通過(guò)EST尋找SSR和SNP分子標(biāo)記從EST數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選SSR和SNP的主要優(yōu)點(diǎn)在于，這樣篩選出來(lái)的SSR和SNP分子標(biāo)記直接與基因的編碼區(qū)相對(duì)應(yīng)，即得到的往往是基因相關(guān)標(biāo)記（geneassociated markers）；另外，從EST中篩選SSR和SNP比從基因組中篩選費(fèi)用要小得多。篩選的大致步驟為：EST重疊群的組裝；通過(guò)對(duì)大量重復(fù)的EST進(jìn)行序列比較，識(shí)別出候選SSR或SNP；對(duì)候選SSR或SNP進(jìn)行確認(rèn)?？傊?，通過(guò)對(duì)大量EST數(shù)據(jù)的歸納整理是尋找SSR和SNP以構(gòu)建高密度遺傳圖譜的最經(jīng)濟(jì)的方法。除了以上用途外，EST還在基因結(jié)構(gòu)分析（內(nèi)含子、外顯子識(shí)別）、基因表達(dá)及重組蛋白表達(dá)的分析中具有重要作用。（5）RNAi技術(shù)的研究結(jié)合GATEWAY技術(shù)和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)用于突變體庫(kù)建立的RNAi技術(shù)，開(kāi)發(fā)出了pHellsgate 系列載體，將該技術(shù)與cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)和大規(guī)模EST測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，使得大規(guī)?；虻那贸蔀榱丝赡?。RNAi 指外源性雙鏈RNA (dsRNA )能抑制細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的基因的表達(dá)。在進(jìn)化上，這可能是生物調(diào)控基因表達(dá)及抵御病毒侵染或轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)DNA突變的一種共生有的生理機(jī)制。該技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以獲得大規(guī)模的缺失突變體，為基因功能的研究提供了很好的研究工具，同時(shí)EST作為序列標(biāo)簽，可以很好地實(shí)現(xiàn)表型相關(guān)的基因克隆。 不足和展望EST技術(shù)己成為一種強(qiáng)有力的工具，幫助人們揭示基因組所包含的信息，使基因組研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。隨著“后基因組”時(shí)代的到來(lái)，生物信息學(xué)在基因功能研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。而EST數(shù)據(jù)處理和分析是生物信息學(xué)分析的核心任務(wù)之一，它為新基因的克隆和功能分析提供了新的出發(fā)點(diǎn)。EST數(shù)據(jù)庫(kù)為新基因的發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)研究提供了大量的信息和分析材料，也為DNA分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。但是，目前EST研究還存在許多問(wèn)題。第一，大量EST序列信息整理的問(wèn)題。隨著EST數(shù)據(jù)的不斷增加，利用生物信息學(xué)方法建立高通量、自動(dòng)化的EST數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，己成為EST研究急需解決的問(wèn)題之一；第二，EST文庫(kù)中基因表達(dá)豐度的問(wèn)題。植物基因組極其龐大，某一特定組織在特定時(shí)期的基因表達(dá)頻率各不相同。在獲取有用的、新的EST方面效率較低，人力物力浪費(fèi)嚴(yán)重；第三，就世界范圍來(lái)講，如何避免不同研究機(jī)構(gòu)對(duì)同一物種進(jìn)行重復(fù)測(cè)序，協(xié)調(diào)好科學(xué)家之間的分工，加快植物EST計(jì)劃的進(jìn)程，也是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。 原理和方法（1）基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)SAGE技術(shù)是由Velculescu 等人[15]在 1995 提出，是一種可以定量并同時(shí)分析大量轉(zhuǎn)錄本的方法。1998年，Powell[16]利用生物素標(biāo)記的PCR引物合成生物素標(biāo)記的接頭，并利用鏈霉抗生物素蛋白磁珠綁定接頭，這就有效地去除了一些多余的接頭，從而提高了 SAGE技術(shù)分析的
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