【文章內(nèi)容簡介】 本的遺傳背景方向純合。培育植物近等基因系主要有以下選育方法（張潔夫，2002）：第一，多次回交選育法。就是將材料與輪回親本連續(xù)回交，通常需回交6代以上。即替換掉控制目標(biāo)性狀的等位基因，使育成材料除目標(biāo)性狀與輪回親本存在差異外，其遺傳背景逐步接近輪回親本或與輪回親本一致，從而兩者成為近等基因系。該方法是培育近等基因系中最常用的方法，如農(nóng)作物抗病、抗逆性近等基因系的構(gòu)建。第二，從突變體中分離獲得。通常情況下，單個(gè)位點(diǎn)的突變并不會引起其他位點(diǎn)的變異。即通過誘變獲得的突變體與原品種（系）相比，除突變位點(diǎn)存在差異之外，其他位點(diǎn)基本一致，從而可以從中選育出近等基因系。第三，結(jié)合分子標(biāo)記檢測技術(shù)連續(xù)回交選育法。一般先進(jìn)行若干代回交試驗(yàn)，在建立多次回交群體的基礎(chǔ)上，對目標(biāo)基因進(jìn)行前景選擇，同時(shí)進(jìn)行背景選擇。選擇與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，選育近等基因系。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，這一方法正在成為近等基因系選育的有效方法之一。第四，雜交高世代分離群體材料中分離選育。由于在雜交高世代群體中，大多數(shù)控制性狀的基因趨于純合，僅少數(shù)基因處于雜合狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上從中選育具有目標(biāo)性狀差異的品系構(gòu)建近等基因系。目前，用于作物數(shù)量性狀基因座位研究的作圖群體多種多樣，根據(jù)作圖群體中個(gè)體間遺傳背景差異程度和對QTL檢測的分辨率來看可分為初級群體和高級群體。初級群體是指由兩個(gè)遺傳差異相對較大的親本相互雜交而建立的分離群體，這類分離群體的特點(diǎn)是全基因組均發(fā)生分離，其中主要包括FFBCRILs（rebinantinbred lines）、DH（double hap1oid）等。高級作圖群體主要是指近等基因系類群體，其特征是在群體內(nèi)，個(gè)體間的遺傳背景相似，僅帶有少數(shù)供體片斷。例如導(dǎo)入系或滲入系（Introgression Lines，ILs）和替換系（Substitution lines，SLs），它們都是通過連續(xù)重復(fù)的回交和分子標(biāo)記輔助選擇來完成的。近等基因系與受體親本的差別主要在目標(biāo)QTL所在的染色體區(qū)域，所以，它們之間的任何表型性狀的差異都來源于這個(gè)供體片段。從近等基因系發(fā)展而來的分離群體，只在與親本有差異的染色體區(qū)域發(fā)生分離，從而消除背景的干擾及主效QTL對微效QTL的掩蓋作用。因此，利用近等基因系發(fā)展而來的分 離群體是非常適合進(jìn)行QTL精細(xì)定位、QTL互作、品種改良等的良好材料。 QTL精細(xì)定位Takeuchi等（Takeuchi et al. 2003）用一個(gè)只含有單個(gè)供體染色體片段 的近等基因系群體（96株），對水稻的兩個(gè)緊密連鎖的QTL：種子休眠性（Seed dormancy） QTLSdr1和抽穗天數(shù)QTLHd8進(jìn)行 精細(xì)定位，將Sdr1定位在RFLP標(biāo)記 R10942和C2045之間，與C1488共分離；將Hd8定位于RFLP標(biāo)記C1534S 和R10942之間。Hittalmani（Hittalmani et a1. 2002）和Berruyer （Berruyer et al. 2003）用近等基因系分離群體對水稻的四個(gè)抗稻瘟病基因：PiPiz Pita和Pi33進(jìn)行了精細(xì)定位。Murai（Murai et al. 2001） cM的范圍之內(nèi)，距離AFLP標(biāo)記KAM3 cM，距標(biāo)記KAM5 cM，與標(biāo)記KAM4共分離。Yamamoto（Yamamoto et a1. 1998）利用分別帶有水稻抽穗天數(shù)的QTLHdHdHd3三個(gè)近等基因系相互雜交，研究了三個(gè)QTL間的互作，結(jié)果表明，Hd1和HdHd2和HdHd1和Hd3之間都存在上位性互作。進(jìn)一步研究表明，在田間條件下，控制水稻的抽穗天數(shù)的QTLHd2對另一個(gè)控制抽穗天數(shù)的QTLHd6也有上位性互作效應(yīng)，即Hd2的存在掩蓋Hd6對延長抽穗天數(shù)的特性（Yamamotoet a1. 2000）。 克隆Yano（Yano et ）利用含有1505個(gè)單株的近等基因系群體對水稻的光敏感 QTLHd1進(jìn)行了圖位克隆（Mapbased cloning），將Hd1定位在12 KB的范圍內(nèi)。進(jìn)一步的分析表明，Hd1基因與控制擬南芥開花期的基因CONSTANS相似。Takahashi（Takahashi et a1．2001）利用近等基因系對控制水稻光周期敏感的QTLHd6進(jìn)行了圖位克隆， KB的區(qū)域內(nèi)，Hd6編碼蛋白激酶CK2 的一個(gè)亞單位。Blair（Blair et al．2003）利用含有1016個(gè)單株的的等基因系群體把控制水稻抗白葉枯病的基因Xa5定位于70KB的范圍內(nèi)，該區(qū)域內(nèi)包含11個(gè)開放閱讀框（ORF：open reading frame）。Gu（Gu et a1. 2004）利用含有2369個(gè)單株的近等基因系群體，對控制水稻抗白葉枯病抗性基因xa27進(jìn)行了精細(xì)定位，將xa27定位于第6號染色體長臂上的分子標(biāo)記M1081與 M1059之間。用染色體著陸法（chromosome landing） cM 的基因組范圍之內(nèi)，處于分子標(biāo)記 M964和 M1197之間，與分子標(biāo)記 M63M1230 和 M499共分離。在作物品種改良方面，很多育種專家對一些地方品種、野生種及可雜交的近緣物種中的特殊種質(zhì)資源非常青睞，在育種工作上常利用某一作物的栽培品種作為輪回親本（RP），含有優(yōu)良性狀基因的種質(zhì)資源作為供體親本（DP），進(jìn)行雜交。然后經(jīng)多次重復(fù)回交，把優(yōu)良性狀如抗病性、抗蟲性導(dǎo)人栽培品種中。在回交過程中，選擇基因組與輪回親本的基因逐步趨近，且具有供體目標(biāo)基因的后代株系，兩者的相似程度隨回交世代數(shù)的增加而增加，而在輪回親本的近等基因系中，非目的基因的供體親本的染色體片段和位點(diǎn)逐代減少，這樣的回交后代株系和輪回親本組成了一對近等基因系。也就是說近等基因系是遺傳背景相同，然而等位基因性質(zhì)不同的一組品系，在過去的研究中，由于品種之間遺傳背景的不同，往往無法比較出控制品種間某個(gè)性狀的基因型的差異，而應(yīng)用近等基因第則可以克服這種困擾。國外利用某些攜有抗病害、蟲害不同抗性基因的近等基因系作為一致遺傳背景的抗性鑒別品種，鑒定和檢測小種（生物型）及新的抗性基因，或直接用作為育種計(jì)劃的供體（Paterson 1993 ）。Bcmacchi（Bcmacchi et a1. 1998）定位番茄的15個(gè)基因組區(qū)段作為目標(biāo)，通過RFLP標(biāo)記輔助選擇，建立了23個(gè)含有單個(gè)供體染色體片段 的近等基因系，并進(jìn)一步對這些近等基因系的控制7個(gè)性狀的25個(gè)數(shù)量性狀因子進(jìn)行效應(yīng)分析。有22個(gè)（88％）數(shù)量性狀因子 表型得到了不同程度的改良。Saito（Saito et a1. 2001）依據(jù)早代用雙單倍體群體對水稻根部性狀 QTL定位的結(jié)果，通過標(biāo)記輔助選擇以及回交跟蹤4個(gè)目標(biāo)區(qū)段，構(gòu)建了水稻根部性狀的 29個(gè)近等基因系；其中，1個(gè)近等基因系可以明顯改良受體親本IR64的根部性狀，3個(gè)近等基因系可以明顯改良水稻的深水根重，1個(gè)近等基因系可以明顯改良水稻的最大根長。另外，近等基因系還是在基因水平上研究 抗性遺傳和機(jī)制的極佳的材料。通過對近等基因的分析，表明多態(tài)性的片段可能就是和目標(biāo)基因相連鎖的分子標(biāo)記，并且可對分離后代的分析來驗(yàn)證（姚景俠等，1990；鐘少斌等，1993；劉金元，1996；李松濤等，1995；賈繼增等，1996；樸春根等，1997；劉秉華，1997）?；蚪M學(xué)時(shí)代的首要任務(wù)是制作圖譜和測定序列，后基因組學(xué)時(shí)代則是對基因組功能進(jìn)行注釋(Genome annotation)，這同樣是功能基因組學(xué)的首要研究目標(biāo)。基因克隆是使用體外重組技術(shù)把特定的基因和其它DNA 順序插入到載體分子內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，其目標(biāo)就是識別分離出來的特異基因并獲得基因的完整序列，確定染色體的定位，以及闡明其機(jī)理，并利用生物工程手段將其應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去。首先，功能克隆法就是根據(jù)性狀的基本生化特征，鑒定已知基因的功能后進(jìn)而分離目標(biāo)基因的一種方法。在生物種、屬之間，基因編碼區(qū)的同源性一般都比非編碼區(qū)的高，如果克隆其他種、屬的同源序列，構(gòu)建含目標(biāo)基因的cDNA文庫，然后用已知的基因序 列作為探針，可以克隆到同源基因。Wang (Wang et al. 1997)用一個(gè)稻谷β淀粉酶cDNA作為探針，從玉米的cDNA文庫中篩選出玉米的β淀粉酶基因。Martin (Martin B et al. 1997)用綠豆C4H基因的cDNA作為探針，從擬南芥的cDNA文庫中篩選出編碼肉桂酸4羥基酶的基因(C4H)。分離出一個(gè)高純度的蛋白質(zhì)是功能克隆法的關(guān)鍵，但由于目前大多數(shù)基因的產(chǎn)物還不是很清楚，即使知道了，要純化到可供氨基酸測序及制備抗體的蛋白質(zhì)也非常困難。同時(shí)，由于遺傳密碼簡并性的存在，推導(dǎo)出具有特異的探針是很難的。所以，很難用這一方法對大多數(shù)基因進(jìn)行克隆。其次，對未知產(chǎn)物基因克隆的方法主要有：圖位克隆法、同源序列法、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、差異基因表達(dá)的分離方法和表達(dá)序列標(biāo)簽法（EST）。圖位克隆（Mapbased cloning）又被稱為定位克?。≒ositional cloning），此方法是先把目標(biāo)基因精確定位于分子標(biāo)記連鎖圖上，利用與目的基因緊密連鎖的標(biāo)記篩選大片段DNA文庫(如BAC、YAC、或Cosmid文庫)，并構(gòu)建含有目標(biāo)基因區(qū)域的精細(xì)物理圖譜，然后采用染色體步行(Chromosome walking) 的方法逐步逼近目的基因，最后，用含目標(biāo)基因的大片段克隆做亞克隆分析， 或作為探針篩選cDNA文庫，通過功能驗(yàn)證確定基因。眾多研究者已經(jīng)用圖位克隆法分離和克隆了很多基因，例如擬南芥的脫落酸信號傳導(dǎo)基因ABI3 (Giraudat et al.，1992 )和ω3脂肪酸脫飽和酶基因FAD3 (Arondel et al.，1992)，番茄抗霜霉病基因Cf2基因 (Dixon et al.，1996)和Pto (Martin et al.，1993)，水稻的分蘗數(shù)基因Moc1（Li et al.，2003）、水稻矮桿基因dll (Tanabeet al.，2005)，大麥抗白粉病基因Mol (McDowell et al.，1998)，小麥抗線蟲基因Cre3 (Lagudahet al.，1997)，甜菜的Hslpro1基因 (Cai et al.，1997) 及200多個(gè)與人類遺傳性疾病相關(guān)的基因克隆等。目前用圖位克隆法而得到的QTL克隆主要有番茄果重QTL (Fridman et al.，2000)等克隆以及水稻抽穗期QTL Hd1 (Yano et al.,2000)、HdHd6。使用圖位克隆的方法克隆基因的前提是：需要完整的基因組文庫，飽和的分子標(biāo)記連鎖圖，完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系，大量的測序工作。因而僅局限應(yīng)用在人類、番茄、水稻、擬南芥等圖譜飽和生物上。轉(zhuǎn)座子或TDNA標(biāo)簽法。使用轉(zhuǎn)座子插入到某一個(gè)功能基因的內(nèi)部或者鄰近區(qū)域時(shí)，就會使該基因失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生出突變型。以轉(zhuǎn)座子DNA為探針，經(jīng)過 篩選變異株的基因文庫，找到該轉(zhuǎn)座子的部分片段，再以突變基因的部 分序列作探針，從野生型文庫里 克隆出完整的基因。常用的轉(zhuǎn)座子有金魚草的Tam3和玉米的Ac/Ds、En/Smp。自從Fedoroff ( Fedoroff et )首次通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法從玉米中克隆出 Bz1基因以來，已從玉米中克隆出了A1基因、C1基因、Kn1基因、Bz2等基因，從金魚草中克隆出Deficiens基因 (顧紅雅，1995)、Pa1基因。TDNA標(biāo)簽法和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法的基本原理是一致的，只是TDNA標(biāo)簽法的突變由TDNA的插入所致。Feldmann(Feldmann 1989) 通過 利用TDNA插入，得到了擬南芥的矮化突變體。TDNA標(biāo)簽法成功的關(guān)鍵是能否篩選出由轉(zhuǎn)座子插入所致的突變體。表達(dá)序列標(biāo)簽法（expressed sequence tag,EST）是在完整的基因上能夠特異性標(biāo)記基因的某一部分序列，從而與其它基因相區(qū)分，通常都包含了足夠的基因結(jié)構(gòu)信息區(qū)。大量的EST克隆以及EST資料庫的建立，為使用生物信息學(xué)的方法克隆基因提供了前提條件。林慧賢（林慧賢等 2001）利用EST克隆得到了1個(gè)新的水稻GTP蛋白基因Osrab5B的cDNA克?。籎antasuriyarat (Jantasuriyarat et )通過EST克隆鑒定了水稻稻瘟病 感染的相關(guān)基因。目前，擬南芥、水稻、番茄、玉米、馬鈴薯、甜菜、小麥、大麥、胡椒等作物都已經(jīng)有克隆QTL的報(bào)道，其中，利用圖位克隆法克隆得到的QTL主要來自番茄、擬南芥和水稻等模式植物。例如水稻抽穗期QTL HdHdHd3和Ehd1；而分別作用于番茄糖含量、果重和果形的Brix925；分別控制玉米開花期、玉米果殼進(jìn)化和油分含量及組成成分的Vgttga1和DGAT?；ㄉ盏拇嬖趯χ参矬w本身有許多重要的作用?；ò曛泻谢ㄉ帐蛊漕伾r艷，有利于花粉傳播和后代繁殖（趙昶靈，郭華春 2007），種子和果實(shí)中花色苷的積累有利于預(yù)防害蟲和紫外線的傷害，與其抗逆性密切相關(guān)（Hichem et al. 2009； Zhang et al. 2010； Takele 2010； Sperdouliamp。Moustakas 2012）。此外，花色苷對人體具有多種生理保健功能?；ㄉ兆钪饕纳砘钚怨δ苁亲杂苫宄芰涂寡趸芰?，花色苷的抗氧化能力是VE的50倍，VC的20倍，而且其對人體的生物有效性是100%，服用后20分鐘就能在血液中檢測到（唐忠厚，周麗 2009）?；ㄉ湛梢愿纳迫撕蛣?dòng)物的整體視覺功能，研究報(bào)道，花色苷提高視覺靈敏度的主要原因是花色苷刺激視網(wǎng)膜色素再生（Matsumoto et al. 2003）。Hou等發(fā)現(xiàn)花色苷可以阻塞有活性的分裂素蛋白至活酶路徑，從而有效抑制腫瘤的發(fā)生（Hou et al. 2004）。Makoto等發(fā)現(xiàn)花色苷提取物可有效抑制突變作用(Makoto et al. 2001)?；ㄉ赵谘軆?nèi)皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激保護(hù)作用可以效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生（Youdim et al. 2000）。Tsuda等的試驗(yàn)證明花色苷可以作為功能保健食品，有效預(yù)防肥胖和糖尿?。═suda et al. 2003）。到目前，花色苷的抗微生物活性已被確定，比如抑制黃曲霉生物活性（