【文章內(nèi)容簡介】 本的遺傳背景方向純合。培育植物近等基因系主要有以下選育方法（張潔夫，2002）：第一，多次回交選育法。就是將材料與輪回親本連續(xù)回交，通常需回交6代以上。即替換掉控制目標性狀的等位基因，使育成材料除目標性狀與輪回親本存在差異外，其遺傳背景逐步接近輪回親本或與輪回親本一致，從而兩者成為近等基因系。該方法是培育近等基因系中最常用的方法，如農(nóng)作物抗病、抗逆性近等基因系的構建。第二，從突變體中分離獲得。通常情況下，單個位點的突變并不會引起其他位點的變異。即通過誘變獲得的突變體與原品種（系）相比，除突變位點存在差異之外，其他位點基本一致，從而可以從中選育出近等基因系。第三，結合分子標記檢測技術連續(xù)回交選育法。一般先進行若干代回交試驗，在建立多次回交群體的基礎上，對目標基因進行前景選擇，同時進行背景選擇。選擇與目標性狀緊密連鎖的分子標記進行檢測，選育近等基因系。隨著分子標記技術的不斷進步和完善，這一方法正在成為近等基因系選育的有效方法之一。第四，雜交高世代分離群體材料中分離選育。由于在雜交高世代群體中，大多數(shù)控制性狀的基因趨于純合，僅少數(shù)基因處于雜合狀態(tài)，在此基礎上從中選育具有目標性狀差異的品系構建近等基因系。目前，用于作物數(shù)量性狀基因座位研究的作圖群體多種多樣，根據(jù)作圖群體中個體間遺傳背景差異程度和對QTL檢測的分辨率來看可分為初級群體和高級群體。初級群體是指由兩個遺傳差異相對較大的親本相互雜交而建立的分離群體，這類分離群體的特點是全基因組均發(fā)生分離，其中主要包括FFBCRILs（rebinantinbred lines）、DH（double hap1oid）等。高級作圖群體主要是指近等基因系類群體，其特征是在群體內(nèi)，個體間的遺傳背景相似，僅帶有少數(shù)供體片斷。例如導入系或滲入系（Introgression Lines，ILs）和替換系（Substitution lines，SLs），它們都是通過連續(xù)重復的回交和分子標記輔助選擇來完成的。近等基因系與受體親本的差別主要在目標QTL所在的染色體區(qū)域，所以，它們之間的任何表型性狀的差異都來源于這個供體片段。從近等基因系發(fā)展而來的分離群體，只在與親本有差異的染色體區(qū)域發(fā)生分離，從而消除背景的干擾及主效QTL對微效QTL的掩蓋作用。因此，利用近等基因系發(fā)展而來的分 離群體是非常適合進行QTL精細定位、QTL互作、品種改良等的良好材料。 QTL精細定位Takeuchi等（Takeuchi et al. 2003）用一個只含有單個供體染色體片段 的近等基因系群體（96株），對水稻的兩個緊密連鎖的QTL：種子休眠性（Seed dormancy） QTLSdr1和抽穗天數(shù)QTLHd8進行 精細定位，將Sdr1定位在RFLP標記 R10942和C2045之間，與C1488共分離；將Hd8定位于RFLP標記C1534S 和R10942之間。Hittalmani（Hittalmani et a1. 2002）和Berruyer （Berruyer et al. 2003）用近等基因系分離群體對水稻的四個抗稻瘟病基因：PiPiz Pita和Pi33進行了精細定位。Murai（Murai et al. 2001） cM的范圍之內(nèi)，距離AFLP標記KAM3 cM，距標記KAM5 cM，與標記KAM4共分離。Yamamoto（Yamamoto et a1. 1998）利用分別帶有水稻抽穗天數(shù)的QTLHdHdHd3三個近等基因系相互雜交，研究了三個QTL間的互作，結果表明，Hd1和HdHd2和HdHd1和Hd3之間都存在上位性互作。進一步研究表明，在田間條件下，控制水稻的抽穗天數(shù)的QTLHd2對另一個控制抽穗天數(shù)的QTLHd6也有上位性互作效應，即Hd2的存在掩蓋Hd6對延長抽穗天數(shù)的特性（Yamamotoet a1. 2000）。 克隆Yano（Yano et ）利用含有1505個單株的近等基因系群體對水稻的光敏感 QTLHd1進行了圖位克?。∕apbased cloning），將Hd1定位在12 KB的范圍內(nèi)。進一步的分析表明，Hd1基因與控制擬南芥開花期的基因CONSTANS相似。Takahashi（Takahashi et a1．2001）利用近等基因系對控制水稻光周期敏感的QTLHd6進行了圖位克隆， KB的區(qū)域內(nèi)，Hd6編碼蛋白激酶CK2 的一個亞單位。Blair（Blair et al．2003）利用含有1016個單株的的等基因系群體把控制水稻抗白葉枯病的基因Xa5定位于70KB的范圍內(nèi)，該區(qū)域內(nèi)包含11個開放閱讀框（ORF：open reading frame）。Gu（Gu et a1. 2004）利用含有2369個單株的近等基因系群體，對控制水稻抗白葉枯病抗性基因xa27進行了精細定位，將xa27定位于第6號染色體長臂上的分子標記M1081與 M1059之間。用染色體著陸法（chromosome landing） cM 的基因組范圍之內(nèi)，處于分子標記 M964和 M1197之間，與分子標記 M63M1230 和 M499共分離。在作物品種改良方面，很多育種專家對一些地方品種、野生種及可雜交的近緣物種中的特殊種質(zhì)資源非常青睞，在育種工作上常利用某一作物的栽培品種作為輪回親本（RP），含有優(yōu)良性狀基因的種質(zhì)資源作為供體親本（DP），進行雜交。然后經(jīng)多次重復回交，把優(yōu)良性狀如抗病性、抗蟲性導人栽培品種中。在回交過程中，選擇基因組與輪回親本的基因逐步趨近，且具有供體目標基因的后代株系，兩者的相似程度隨回交世代數(shù)的增加而增加，而在輪回親本的近等基因系中，非目的基因的供體親本的染色體片段和位點逐代減少，這樣的回交后代株系和輪回親本組成了一對近等基因系。也就是說近等基因系是遺傳背景相同，然而等位基因性質(zhì)不同的一組品系，在過去的研究中，由于品種之間遺傳背景的不同，往往無法比較出控制品種間某個性狀的基因型的差異，而應用近等基因第則可以克服這種困擾。國外利用某些攜有抗病害、蟲害不同抗性基因的近等基因系作為一致遺傳背景的抗性鑒別品種，鑒定和檢測小種（生物型）及新的抗性基因，或直接用作為育種計劃的供體（Paterson 1993 ）。Bcmacchi（Bcmacchi et a1. 1998）定位番茄的15個基因組區(qū)段作為目標，通過RFLP標記輔助選擇，建立了23個含有單個供體染色體片段 的近等基因系，并進一步對這些近等基因系的控制7個性狀的25個數(shù)量性狀因子進行效應分析。有22個（88％）數(shù)量性狀因子 表型得到了不同程度的改良。Saito（Saito et a1. 2001）依據(jù)早代用雙單倍體群體對水稻根部性狀 QTL定位的結果，通過標記輔助選擇以及回交跟蹤4個目標區(qū)段，構建了水稻根部性狀的 29個近等基因系；其中，1個近等基因系可以明顯改良受體親本IR64的根部性狀，3個近等基因系可以明顯改良水稻的深水根重，1個近等基因系可以明顯改良水稻的最大根長。另外，近等基因系還是在基因水平上研究 抗性遺傳和機制的極佳的材料。通過對近等基因的分析，表明多態(tài)性的片段可能就是和目標基因相連鎖的分子標記，并且可對分離后代的分析來驗證（姚景俠等，1990；鐘少斌等，1993；劉金元，1996；李松濤等，1995；賈繼增等，1996；樸春根等，1997；劉秉華，1997）?；蚪M學時代的首要任務是制作圖譜和測定序列，后基因組學時代則是對基因組功能進行注釋(Genome annotation)，這同樣是功能基因組學的首要研究目標?；蚩寺∈鞘褂皿w外重組技術把特定的基因和其它DNA 順序插入到載體分子內(nèi)進行擴增，其目標就是識別分離出來的特異基因并獲得基因的完整序列，確定染色體的定位，以及闡明其機理，并利用生物工程手段將其應用到生產(chǎn)實踐中去。首先，功能克隆法就是根據(jù)性狀的基本生化特征，鑒定已知基因的功能后進而分離目標基因的一種方法。在生物種、屬之間，基因編碼區(qū)的同源性一般都比非編碼區(qū)的高，如果克隆其他種、屬的同源序列，構建含目標基因的cDNA文庫，然后用已知的基因序 列作為探針，可以克隆到同源基因。Wang (Wang et al. 1997)用一個稻谷β淀粉酶cDNA作為探針，從玉米的cDNA文庫中篩選出玉米的β淀粉酶基因。Martin (Martin B et al. 1997)用綠豆C4H基因的cDNA作為探針，從擬南芥的cDNA文庫中篩選出編碼肉桂酸4羥基酶的基因(C4H)。分離出一個高純度的蛋白質(zhì)是功能克隆法的關鍵，但由于目前大多數(shù)基因的產(chǎn)物還不是很清楚，即使知道了，要純化到可供氨基酸測序及制備抗體的蛋白質(zhì)也非常困難。同時，由于遺傳密碼簡并性的存在，推導出具有特異的探針是很難的。所以，很難用這一方法對大多數(shù)基因進行克隆。其次，對未知產(chǎn)物基因克隆的方法主要有：圖位克隆法、同源序列法、轉座子標簽法、差異基因表達的分離方法和表達序列標簽法（EST）。圖位克?。∕apbased cloning）又被稱為定位克?。≒ositional cloning），此方法是先把目標基因精確定位于分子標記連鎖圖上，利用與目的基因緊密連鎖的標記篩選大片段DNA文庫(如BAC、YAC、或Cosmid文庫)，并構建含有目標基因區(qū)域的精細物理圖譜，然后采用染色體步行(Chromosome walking) 的方法逐步逼近目的基因，最后，用含目標基因的大片段克隆做亞克隆分析， 或作為探針篩選cDNA文庫，通過功能驗證確定基因。眾多研究者已經(jīng)用圖位克隆法分離和克隆了很多基因，例如擬南芥的脫落酸信號傳導基因ABI3 (Giraudat et al.，1992 )和ω3脂肪酸脫飽和酶基因FAD3 (Arondel et al.，1992)，番茄抗霜霉病基因Cf2基因 (Dixon et al.，1996)和Pto (Martin et al.，1993)，水稻的分蘗數(shù)基因Moc1（Li et al.，2003）、水稻矮桿基因dll (Tanabeet al.，2005)，大麥抗白粉病基因Mol (McDowell et al.，1998)，小麥抗線蟲基因Cre3 (Lagudahet al.，1997)，甜菜的Hslpro1基因 (Cai et al.，1997) 及200多個與人類遺傳性疾病相關的基因克隆等。目前用圖位克隆法而得到的QTL克隆主要有番茄果重QTL (Fridman et al.，2000)等克隆以及水稻抽穗期QTL Hd1 (Yano et al.,2000)、HdHd6。使用圖位克隆的方法克隆基因的前提是：需要完整的基因組文庫，飽和的分子標記連鎖圖，完善的遺傳轉化體系，大量的測序工作。因而僅局限應用在人類、番茄、水稻、擬南芥等圖譜飽和生物上。轉座子或TDNA標簽法。使用轉座子插入到某一個功能基因的內(nèi)部或者鄰近區(qū)域時，就會使該基因失活，并誘導產(chǎn)生出突變型。以轉座子DNA為探針，經(jīng)過 篩選變異株的基因文庫，找到該轉座子的部分片段，再以突變基因的部 分序列作探針，從野生型文庫里 克隆出完整的基因。常用的轉座子有金魚草的Tam3和玉米的Ac/Ds、En/Smp。自從Fedoroff ( Fedoroff et )首次通過轉座子標簽法從玉米中克隆出 Bz1基因以來，已從玉米中克隆出了A1基因、C1基因、Kn1基因、Bz2等基因，從金魚草中克隆出Deficiens基因 (顧紅雅，1995)、Pa1基因。TDNA標簽法和轉座子標簽法的基本原理是一致的，只是TDNA標簽法的突變由TDNA的插入所致。Feldmann(Feldmann 1989) 通過 利用TDNA插入，得到了擬南芥的矮化突變體。TDNA標簽法成功的關鍵是能否篩選出由轉座子插入所致的突變體。表達序列標簽法（expressed sequence tag,EST）是在完整的基因上能夠特異性標記基因的某一部分序列，從而與其它基因相區(qū)分，通常都包含了足夠的基因結構信息區(qū)。大量的EST克隆以及EST資料庫的建立，為使用生物信息學的方法克隆基因提供了前提條件。林慧賢（林慧賢等 2001）利用EST克隆得到了1個新的水稻GTP蛋白基因Osrab5B的cDNA克??；Jantasuriyarat (Jantasuriyarat et )通過EST克隆鑒定了水稻稻瘟病 感染的相關基因。目前，擬南芥、水稻、番茄、玉米、馬鈴薯、甜菜、小麥、大麥、胡椒等作物都已經(jīng)有克隆QTL的報道，其中，利用圖位克隆法克隆得到的QTL主要來自番茄、擬南芥和水稻等模式植物。例如水稻抽穗期QTL HdHdHd3和Ehd1；而分別作用于番茄糖含量、果重和果形的Brix925；分別控制玉米開花期、玉米果殼進化和油分含量及組成成分的Vgttga1和DGAT。花色苷的存在對植物體本身有許多重要的作用。花瓣中含有花色苷使其顏色鮮艷，有利于花粉傳播和后代繁殖（趙昶靈，郭華春 2007），種子和果實中花色苷的積累有利于預防害蟲和紫外線的傷害，與其抗逆性密切相關（Hichem et al. 2009； Zhang et al. 2010； Takele 2010； Sperdouliamp。Moustakas 2012）。此外，花色苷對人體具有多種生理保健功能?；ㄉ兆钪饕纳砘钚怨δ苁亲杂苫宄芰涂寡趸芰Γㄉ盏目寡趸芰κ荲E的50倍，VC的20倍，而且其對人體的生物有效性是100%，服用后20分鐘就能在血液中檢測到（唐忠厚，周麗 2009）?；ㄉ湛梢愿纳迫撕蛣游锏恼w視覺功能，研究報道，花色苷提高視覺靈敏度的主要原因是花色苷刺激視網(wǎng)膜色素再生（Matsumoto et al. 2003）。Hou等發(fā)現(xiàn)花色苷可以阻塞有活性的分裂素蛋白至活酶路徑，從而有效抑制腫瘤的發(fā)生（Hou et al. 2004）。Makoto等發(fā)現(xiàn)花色苷提取物可有效抑制突變作用(Makoto et al. 2001)?；ㄉ赵谘軆?nèi)皮細胞中的氧化應激保護作用可以效預防心血管疾病的發(fā)生（Youdim et al. 2000）。Tsuda等的試驗證明花色苷可以作為功能保健食品，有效預防肥胖和糖尿?。═suda et al. 2003）。到目前，花色苷的抗微生物活性已被確定，比如抑制黃曲霉生物活性（