【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 －U、單核子能量直到GeV量級(jí)的重離子束[27]。重離子是指原子序數(shù)等于或大于2的原子被剝離或部分剝離外周電子后帶正電荷的原子核。與X、γ射線(xiàn)及電子束等低LET輻射相比，重離子束具有如下物理學(xué)和生物學(xué)特性：（1）傳能線(xiàn)密度（LET）高，能在生物介質(zhì)中產(chǎn)生高密度的電離和激發(fā)（能量沉積）事件。（2）能量沉積不均勻，入射坪區(qū)吸收劑量相對(duì)恒定，射程末端有一個(gè)能量沉積集中區(qū)，吸收劑量急劇增加，這種深度劑量分布稱(chēng)為布拉格（bragg）峰。（3）靶區(qū)的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)（relative biological effectiveness, REB）高。（4）射程歧離與橫向散射小。（5）輻射敏感性不依賴(lài)細(xì)胞周期時(shí)相，DNA損傷可修復(fù)性小。（6）利用重離子的電性，可在磁場(chǎng)誘導(dǎo)下進(jìn)行三維掃描，利用正電子發(fā)射斷層照相技術(shù)，可實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)。荷能重離子貫穿靶物質(zhì)時(shí)，通過(guò)與靶原子核外電子的碰撞損失其能量，隨離子能量的降低，這種碰撞的幾率增大。因此，離子在接近其射程末端時(shí)損失其大部分初始動(dòng)能，形成一個(gè)高劑量的能量損失峰，這就是布拉格峰，在布拉格峰后劑量吸收趨于零；同時(shí)，離子在其入射通道上損失的能量較小，因而形成一個(gè)低劑量的坪區(qū)。相對(duì)于常規(guī)輻射（X射線(xiàn)、γ射線(xiàn)、電子束、中子束），這就是重離子束特有的倒置深度劑量分布[28]。重離子束能量沉積的布拉格曲線(xiàn)反映了入射離子前段坪區(qū)與后段峰區(qū)的傳能線(xiàn)密度顯著不同，這就使得重離子束在坪區(qū)與峰區(qū)對(duì)生物體的作用表現(xiàn)出不同的效應(yīng)。坪區(qū)的傳能線(xiàn)密度小，相對(duì)生物效應(yīng)接近于1，類(lèi)似于低傳能線(xiàn)密度的常規(guī)輻射，它的細(xì)胞存活劑量效應(yīng)曲線(xiàn)呈肩形，有著修復(fù)效應(yīng)；而處在靶區(qū)范圍內(nèi)的峰區(qū)，其平均傳能線(xiàn)密度較大，相對(duì)生物效應(yīng)大于1，它的細(xì)胞存活劑量效應(yīng)曲線(xiàn)呈指數(shù)或近指數(shù)型，肩區(qū)消失或減小，修復(fù)能力減小或消失。這是常規(guī)輻射無(wú)法做到的。由于入射離子與介質(zhì)原子碰撞的統(tǒng)計(jì)特性，離子束能量損失的漲落會(huì)引起在同一深度上得能量歧離，造成射程歧離，從而導(dǎo)致布拉格峰加寬。但這種歧離效應(yīng)相對(duì)重離子束的絕對(duì)射程而言非常小。例如，對(duì)于射程為10cm的質(zhì)子和碳離子束，%%。重離子束在貫穿介質(zhì)期間多次散射會(huì)導(dǎo)致離子橫向發(fā)散。例如，初始直徑為4mm的質(zhì)子束與碳離子束的束流半高寬，隨貫穿深度的增加而增加，碳離子束貫穿深度達(dá)到20cm時(shí)，橫向擴(kuò)散為初始的25%，相應(yīng)的質(zhì)子束則為170%。細(xì)胞在不同的細(xì)胞周期對(duì)常規(guī)輻射這類(lèi)低傳能線(xiàn)密度射線(xiàn)的輻射敏感性不同。細(xì)胞有絲分裂期間的DNA復(fù)制S期后期，其抗輻射性較強(qiáng)，而有絲分裂M期細(xì)胞的輻射敏感性最強(qiáng)；對(duì)于重離子束這種高傳能線(xiàn)密度輻射，各時(shí)相細(xì)胞輻射敏感性的差別減小。研究表明，:1以上，在相同劑量情況下，峰區(qū)較坪區(qū)有較強(qiáng)的細(xì)胞致死作用。一般認(rèn)為細(xì)胞致死與不可修復(fù)的DNA雙鏈斷裂直接相關(guān)。重離子束輻照誘導(dǎo)細(xì)胞雙鍵斷裂的研究表明，照射結(jié)束時(shí)峰坪雙鏈斷裂產(chǎn)額比約為2:1，而DNA分子修復(fù)3小時(shí)后，測(cè)得的峰坪雙鏈斷裂產(chǎn)額比約為6:1?？梢?jiàn)坪區(qū)照射的DNA分子修復(fù)雙鏈斷裂的能力較大，而細(xì)胞的峰區(qū)照射時(shí)，雙鏈斷裂修復(fù)能力減小或消失，細(xì)胞存活數(shù)量與雙鏈斷裂修復(fù)是一致的，即在坪區(qū)照射時(shí)細(xì)胞具有修復(fù)輻射損傷的能力。二十世紀(jì)八十年代，我國(guó)在蘭州建成了重離子加速器，主要開(kāi)展重離子對(duì)淺層腫瘤的臨床試驗(yàn)，后來(lái)我國(guó)開(kāi)始利用離子注入技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物誘變育種，隨著離子注入技術(shù)在農(nóng)作物中的廣泛應(yīng)用與良好的效果，離子注入的應(yīng)用范圍逐步延伸到微生物誘變育種領(lǐng)域。理論研究與應(yīng)用研究同步進(jìn)行，取得了可喜的進(jìn)展，積累了豐富的理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。理論研究方面，主要集中在重離子對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的改性作用，具體在微生物誘變中著重探索對(duì)遺傳物質(zhì)DNA的作用，以及誘變后突變的形式等生物學(xué)效應(yīng)[29,30]。應(yīng)用研究與理論研究相比發(fā)展較快，已經(jīng)對(duì)多種工業(yè)微生物進(jìn)行誘變選育，并篩選出適合大規(guī)模生產(chǎn)使用的高產(chǎn)優(yōu)良菌種，且較傳統(tǒng)的物理誘變方式具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)在，第一，能誘發(fā)多種突變，突變譜廣。第二，能夠破壞基因連鎖，重組率高；第三，能破壞染色體的結(jié)構(gòu)，改變?nèi)旧w的數(shù)量，誘導(dǎo)易位系和非整倍體。第四，樣品處理方法簡(jiǎn)便，突變性狀穩(wěn)定快，育種周期短。重離子輻照育種對(duì)樣品的要求不高，對(duì)微生物樣品要求也比較低，也是其優(yōu)勢(shì)之一。微生物樣本制成菌懸液即可進(jìn)行輻照誘變。二十世紀(jì)九十年代以利用蘭州重離子加速器產(chǎn)生的重離子束已經(jīng)研究了許多微生物的誘變效應(yīng)，取得了較好的成果，今天仍然發(fā)揮著重要作用。1998年，頡紅梅等[31]采用40Ar14+重離子輻照對(duì)慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅小單孢菌進(jìn)行誘變處理，%，比一般誘變劑的正突變率高。2004年，李紅玉等[32]應(yīng)用12C6+對(duì)胡蘿卜素生產(chǎn)菌—紅酵母（Rhodotorula RY Strain）進(jìn)行輻照處理，并篩選到了胡蘿卜素產(chǎn)量有變化的輻照變異菌株，對(duì)突變菌株進(jìn)行了RFLP和RAPD分析。2006年，毛淑紅[33]等利用22Ne5+離子束輻照啤酒酵母，篩選呼吸缺陷型酵母菌株，并對(duì)篩選得到的8株呼吸缺陷型酵母進(jìn)行了基于一種新型簡(jiǎn)便的限制性酶切分析手段的遺傳學(xué)鑒定。2009年，陸棟等[34]利用重離子束12C6+輻照選育酒精酵母，篩選得到高產(chǎn)酒精酵母N03A，乙醇產(chǎn)量較原始菌株提高10%。2010年，王曙陽(yáng)等[35]利用12C6+對(duì)阿佛曼鏈霉菌進(jìn)行輻照，50Gy時(shí)致死率97%，%，%%的突變株ZJAVY1203。 微生物發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)微生物發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化主要是指培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，包括培養(yǎng)基組分、pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、種齡、接種量、攪拌、通風(fēng)及補(bǔ)料操作等。這些因素往往不是獨(dú)立影響發(fā)酵過(guò)程，它們之間存在交互作用。由于所涉及的參數(shù)太多，工作量很大，要想取得理想的優(yōu)化結(jié)果必須采用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法是建立在數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上通過(guò)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。試驗(yàn)是科研人員有目的的改變?cè)囼?yàn)體系的輸入變量，以了解體系的響應(yīng)與輸入變量之間的關(guān)系，利用統(tǒng)計(jì)分析手段研究輸入與輸出變量的關(guān)系，更清晰的闡述輸入變量對(duì)試驗(yàn)體系的影響程度。合理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)科學(xué)研究是非常重要的，它不僅節(jié)省人力、物力、財(cái)力和時(shí)間，更重要能夠減少試驗(yàn)誤差，提高試驗(yàn)的精度，取得可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為統(tǒng)計(jì)分析得到正確的結(jié)論打下基礎(chǔ)。通過(guò)借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，把優(yōu)化過(guò)程中設(shè)計(jì)、試驗(yàn)、檢查及分析聯(lián)系在一起，提出用最好的方法作試驗(yàn)，用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法來(lái)處理數(shù)據(jù)。通過(guò)分析、檢驗(yàn)結(jié)果的可信程度，從試驗(yàn)中提煉模型，用各種數(shù)學(xué)表達(dá)式來(lái)描述、評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果、同時(shí)隨著應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)及各種相應(yīng)軟件的飛速發(fā)展，更有效而快速的優(yōu)化設(shè)計(jì)方案被科研人員采納推廣。響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。它是數(shù)學(xué)方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法相結(jié)合，通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立數(shù)學(xué)模型評(píng)估相關(guān)性可以了解系統(tǒng)研究中的響應(yīng)與輸入因子之間的關(guān)系，并且通過(guò)最大化和最小化響應(yīng)以達(dá)到優(yōu)化該響應(yīng)。它采用逐步回歸的方法來(lái)篩選變量，逐步回歸的顯著特點(diǎn)不僅以模型集為基礎(chǔ)求解模型中的各系數(shù)的最小二乘估計(jì)，還能以試驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)和分析比較對(duì)模型集進(jìn)行修正，去除那些對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著的因素，只挑選影響顯著的自變量構(gòu)造回歸方程。RSM使得參數(shù)間的交互作用通過(guò)有限次試驗(yàn)來(lái)評(píng)估成為可能。RSM在科研和生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，逐漸受到眾多科研工作者的青睞。PlackettBurman（PB設(shè)計(jì)）設(shè)計(jì)試驗(yàn)法是一種兩水平的試驗(yàn)優(yōu)化方法。由Plackett和Burman在1946年提出，為多因素二水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是以不完全平衡塊為設(shè)計(jì)原理，這種設(shè)計(jì)用于估計(jì)主效應(yīng)，將主效應(yīng)或者是主要輸入因素優(yōu)化到很少時(shí)，就可以估計(jì)各效應(yīng)之間的交互作用。其優(yōu)點(diǎn)是從眾多發(fā)酵條件快速高效的篩選到接近優(yōu)化響應(yīng)面的因素。經(jīng)過(guò)這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后得到各輸入因素的顯著性的排列，挑選出最顯著因子進(jìn)入到二階優(yōu)化，進(jìn)一步精確接近響應(yīng)的最大。PB設(shè)計(jì)是響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法的前期步驟，研究人員將其與隨機(jī)平衡試驗(yàn)和部分因子試驗(yàn)比包括較發(fā)現(xiàn)，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以更為有效準(zhǔn)確的篩選顯著性輸入因子，并且具有不受因子數(shù)限制的優(yōu)點(diǎn)。RSM主要有三種常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案：BoxBehnken設(shè)計(jì)（BBD）、中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）及均勻外殼設(shè)計(jì)（Uniform Shell Design，USD）。BBD是Box和Behnken將二水平因析設(shè)計(jì)與平衡的和不平衡的不完全區(qū)組設(shè)計(jì)結(jié)合在一起，發(fā)展了一類(lèi)三水平的二階設(shè)計(jì)。BBD的優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)因素只有三個(gè)水平，試驗(yàn)次數(shù)少，在發(fā)酵工業(yè)中得到較大關(guān)注，但同樣由于其因素個(gè)數(shù)限制，一般少于5個(gè)，使其應(yīng)用范圍受到一定限制。CCD是國(guó)際上較為常用的響應(yīng)面法，是一種5水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法。采用該法能夠在有限的試驗(yàn)次數(shù)下，對(duì)影響生物過(guò)程的因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且還能對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化，以獲得影響生物過(guò)程的最佳條件。CCD對(duì)因素和水平的組合具有廣泛的適用性，并且得到的回歸方程與實(shí)際結(jié)果具有良好的擬合性，由于諸多優(yōu)點(diǎn)，中心組合設(shè)計(jì)在發(fā)酵工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。SAS（Statistical Analysis System，統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)）是國(guó)際上通用的數(shù)據(jù)分析軟件。20世紀(jì)60年代，SAS是用于決策支持的大型集成應(yīng)用分析軟件，是國(guó)際統(tǒng)計(jì)分析領(lǐng)域的便準(zhǔn)軟件。目前廣泛應(yīng)用于金融分析、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)、生產(chǎn)制造業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)及教育科研領(lǐng)域，可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、圖表分析、數(shù)理分析、預(yù)測(cè)分析和運(yùn)籌決策等較多領(lǐng)域。SAS系統(tǒng)是一個(gè)完整可靠的統(tǒng)計(jì)分析軟件，主要功能包括方差分析、回歸分析、屬性數(shù)據(jù)分析、多元分析、生存分析、聚類(lèi)分析、判斷分析及非參數(shù)分析等[36]。 高通量技術(shù)與微生物篩選高通量篩選技術(shù)（High Throughput Screening, HTS）是一種利用以往的經(jīng)驗(yàn)去發(fā)現(xiàn)能夠改變生化反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)的一種技術(shù)。人們通過(guò)不同的條件設(shè)置將HTS技術(shù)應(yīng)用于許多方面。目前，高通量篩選技術(shù)廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域不僅僅是藥學(xué)，還包括農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)、催化劑發(fā)現(xiàn)、化妝品發(fā)展，并且只有少數(shù)此類(lèi)學(xué)術(shù)研究已經(jīng)被命名。HTS是高度多學(xué)科交叉的，集合了化學(xué)、生物、工程、信息技術(shù)以及物流管理。有一些基礎(chǔ)的因素是所有的HTS技術(shù)實(shí)際應(yīng)用都具備的。從命名就可以得知，通量，指的是每單位時(shí)間測(cè)定的樣品，是定義的一種測(cè)量，并且數(shù)量應(yīng)該比較大。同樣的，批量篩選代表生物樣品將接受測(cè)試，并且得到一個(gè)測(cè)定結(jié)果。在HTS中，所收集到的化學(xué)樣品集合，或者文庫(kù)，通過(guò)一種生物檢測(cè)來(lái)確定它們?cè)谀撤N疾病過(guò)程中影響特定生化過(guò)程的作用大小。這些模型，被稱(chēng)為靶標(biāo)，其范圍從獨(dú)立的活性蛋白延伸到復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)。HTS中的文庫(kù)以百萬(wàn)個(gè)獨(dú)立樣本容量記，更大容量的操作每年進(jìn)行這種測(cè)定50100次。在HTS中，利用自動(dòng)化來(lái)處理傳遞這種數(shù)量級(jí)別的數(shù)據(jù)[37]。為了更好的理解高通量篩選技術(shù)，必須回顧其發(fā)展歷史。HTS根植于醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展，重點(diǎn)利用于藥物發(fā)現(xiàn)?；炯夹g(shù)在1926年發(fā)現(xiàn)青霉素以后發(fā)展起來(lái)，青霉素之后在1940年成為第一個(gè)人用抗生素。這個(gè)突破性的化合物是在對(duì)成千上萬(wàn)的微生物培養(yǎng)物在平板上進(jìn)行系統(tǒng)的依次測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的。第二次世界大戰(zhàn)后，大多美國(guó)藥廠(chǎng)開(kāi)始生產(chǎn)青霉素，世界性的死亡疾病變得不再可怕。鑒于競(jìng)爭(zhēng)壓力，藥廠(chǎng)開(kāi)始利用同一種基本的方法大規(guī)模的尋找更好的抗生素，就是弗萊明當(dāng)時(shí)所使用的方法。這使得在1940到1950年代發(fā)現(xiàn)了很多新種類(lèi)的抗生素。隨著制藥公司擴(kuò)大此類(lèi)工作的規(guī)模，例如拓展樣本來(lái)源，最終輝瑞公司實(shí)驗(yàn)室的56個(gè)科學(xué)家用了接近一年的時(shí)間測(cè)定了十萬(wàn)個(gè)土壤樣本，這可以說(shuō)是第一個(gè)高通量篩選的實(shí)例。這一項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)了一種新型抗生素土霉素，土霉素至今仍然占領(lǐng)著美國(guó)抗生素市場(chǎng)25%的份額。建立起一種技術(shù)后，高通量篩選就被拓展到其他來(lái)源化學(xué)物質(zhì)的篩選中。最初包括天然植物提取物、真菌提取物和微生物類(lèi)來(lái)源的物質(zhì)，來(lái)尋找用于治療感染的藥物，后來(lái)又用來(lái)篩選治療其他疾病的藥物，例如高血壓、代謝類(lèi)疾病和精神類(lèi)疾病。這些擴(kuò)展都是由于醫(yī)學(xué)的進(jìn)步以及相關(guān)的生物學(xué)方面的進(jìn)步使人們對(duì)疾病的分子影響有了更全面的認(rèn)識(shí)。最開(kāi)始高通量技術(shù)是逐步進(jìn)行改善，到二十世紀(jì)末由于幾個(gè)原因帶來(lái)了極大的改變。1953年DNA的發(fā)現(xiàn)立即帶來(lái)了新的生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域的崛起，隨之而來(lái)的就是使得大規(guī)模生產(chǎn)蛋白和利用基因克隆技術(shù)建立工程細(xì)胞系成為了可能，并且這種方法生產(chǎn)蛋白不再需要繁瑣的凈化過(guò)程。緊接著組合化學(xué)的發(fā)展帶來(lái)了大規(guī)?；瘜W(xué)合成藥物領(lǐng)域的巨大突破。這都使得藥物發(fā)現(xiàn)趨于自動(dòng)化，形成了專(zhuān)門(mén)的篩選平臺(tái)，最終建立起的高通量篩選技術(shù)。盡管高通量技術(shù)是為了新藥物發(fā)現(xiàn)而發(fā)展起來(lái)的，現(xiàn)在也廣泛的應(yīng)用于許多工業(yè)和學(xué)術(shù)領(lǐng)域，彼此互為擴(kuò)展。在學(xué)術(shù)領(lǐng)域，高通量技術(shù)被應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)可用于基礎(chǔ)研究的化學(xué)探針。在工業(yè)領(lǐng)域，高通量技術(shù)已經(jīng)建立起來(lái)并被用來(lái)進(jìn)行更加復(fù)雜的檢測(cè)和大規(guī)模測(cè)定。綜上所述，高通量篩選技術(shù)是復(fù)雜和不斷變化的一種工具，如今廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的許多方面。由于高通量篩選技術(shù)有著微型化、自動(dòng)化、高效化、低廉化的各種特點(diǎn)，非常適合于工業(yè)微生物大規(guī)模篩選的需要[38]。目前利用高通量技術(shù)進(jìn)行菌種篩選的工作多有報(bào)道。1995年孫士勇[39]等探索了在96孔板中進(jìn)行抗脂質(zhì)過(guò)氧化的微量測(cè)定，以Fe2+/半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠肝微粒體為基本模型，根據(jù)硫代巴比妥酸反應(yīng)原理，優(yōu)化不同反應(yīng)條件，建立了一種96孔板上進(jìn)行抗脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定的一步反應(yīng)方法，該方法靈敏度不低于傳統(tǒng)的試管法，而且還具有微量、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于大規(guī)模篩選和研究。2007年比利時(shí)安特衛(wèi)普大學(xué)的研究人員[40]為了測(cè)定藥物對(duì)Giardia duodenalis trophozoites (WBstrain)的抗性，建立了一種基于96孔板的可行、快速、低廉的檢測(cè)方法。2009年譚俊等[41]報(bào)道了一種抗生素化學(xué)效價(jià)的快速高通量分析方法，以紅霉素發(fā)酵為研究對(duì)象建立一套抗生素化學(xué)效價(jià)的高通量分析方法。該方法以硫酸顯色法測(cè)定紅霉素化學(xué)效價(jià)原理為基礎(chǔ)，分析了檢測(cè)器、微孔板介質(zhì)、樣品前處理操作條件等對(duì)檢測(cè)的影響，發(fā)現(xiàn)該方法分析快速，結(jié)果穩(wěn)定。同年，Hong Gao等[42]利用高通量篩選方法對(duì)阿維菌素產(chǎn)生