【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 EvansAY607958Lejeunea flava (Sw.) NeesEF011789Lejeunea pallescens Mitt.EF011772Lejeunea paucidentata (Steph.) GrolleEF011826Nipponolejeunea pilifera AM396291Nipponolejeunea subalpinaAM396290 序列變異程度分析 用BioEdit version [35]將核苷酸序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列并進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)公式 H(l) = Sf(b,l)ln(f(b,l)) 計(jì)算各氨基酸位點(diǎn)的熵值（Entropy value）并繪制熵圖（Entropy plot）。每個(gè)位點(diǎn)的熵值與其他位點(diǎn)的狀態(tài)無(wú)關(guān)，只取決于該位點(diǎn)上各類氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率。熵值的大小反映該位點(diǎn)變異程度的高低[36,37]。 適應(yīng)性進(jìn)化分析采用進(jìn)化分析軟件PAML [13]中的位點(diǎn)模型、分支模型以及分支位點(diǎn)模型（A模型）分析耳葉苔科D1蛋白各位點(diǎn)在適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)受的選擇壓力：位點(diǎn)模型假定系統(tǒng)樹(shù)不同分支所經(jīng)受的選擇壓力相同，但同一分支上的不同氨基酸位點(diǎn)經(jīng)受的選擇壓力不同。本研究選用位點(diǎn)模型中的3 對(duì)模型：M0 (單比率模型)和M3 (離散模型)、 M1a (近中性模型)和M2a (正選擇模型)以及M7 (beta模型)和M8 (betaamp。ω模型) [1415]。其中模型M0、M1a以及M7是空模型，假設(shè)條件中不允許ω 1，而模型M2a、M3以及M8的假設(shè)條件允許ω 1。模型M2a、M3以及M8和他們各自的空模型（M0、M1a以及M7）是相互嵌套的，可以對(duì)它們進(jìn)行似然比檢驗(yàn) (likelihood ratio test, LRT),檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為2? ? (? ? = ?1－?0，??0分別表示兩個(gè)模型下的最大似然值)，依χ2分布檢驗(yàn)其顯著性, 自由度為兩個(gè)模型參數(shù)數(shù)目的差值。分支模型[15,16]允許不同分支所經(jīng)受的選擇壓力不同。其中單比率（oneratio）模型是最簡(jiǎn)單的模型，假設(shè)進(jìn)化樹(shù)上所有分支經(jīng)受的選擇壓力相同，即所有分支具有相同的ω值；自由比率（freeratio）模型假設(shè)不同的分支經(jīng)受不同的選擇壓力，即不同分支具有不同的ω值。分支位點(diǎn)模型[17,18]中的A模型把所有分支分為兩類：前景分支和后景分支，只有前景分支可能受到正選擇作用。該模型中假設(shè)存在四類位點(diǎn)：0類位點(diǎn)在所有分支中都是保守的，其ω值（ω0）介于0到1之間；1類位點(diǎn)在所有分支中受到中性選擇的作用，其ω值（ω1）等于1；2a類位點(diǎn)在背景分支中受到負(fù)選擇，但在前景支中受到正選擇；2b類位點(diǎn)在背景支中受到中性選擇，但在前景支中受到正選擇。該模型包括兩種似然比檢驗(yàn)：檢驗(yàn)1和檢驗(yàn)2，根據(jù)Yang的建議，本研究采用檢驗(yàn)2[13]。此外，將耳葉苔科psbA基因序列提交在線服務(wù)器Datamonkey（）[19]采用FEL（Fixed Effects Likelihood model)模型分析各氨基酸位點(diǎn)經(jīng)受的選擇壓力。最后將序列信息提交在線服務(wù)器SWISSMODEL（）進(jìn)行同源建模[2123]。2 結(jié)果 耳葉苔科系統(tǒng)發(fā)育重建與分歧時(shí)間估計(jì)圖1為基于貝葉斯法構(gòu)建的耳葉苔科各物種psbA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，耳葉苔科較明顯的分為兩大支（）：第一支由毛耳苔屬的Jubula bogotensis Steph.、Jubula hutchinsiae subsp. javanica (Steph.) pilifera、Nipponolejeunea subalpina組成，這與J246。rn Hentschel等[24]所報(bào)道的一致；第二支由毛耳苔屬Jubula hutchinsiae subsp. pennsylvanica (Steph.) 。其中Jubula hutchinsiae (Steph.) 。為準(zhǔn)確估計(jì)耳葉苔科各主要支系的分歧時(shí)間，本研究采用Jochen Heinrichs等[25]報(bào)道的日鱗苔科與耳葉苔科的分歧時(shí)間進(jìn)行單點(diǎn)校正。分析結(jié)果顯示，耳葉苔科第一次分化發(fā)生在約121百萬(wàn)年前，進(jìn)入新生代（）之后分化速度明顯加快，分析可能是與白堊紀(jì)被子植物的興盛以及古新世始新世最熱地質(zhì)事件有關(guān)。圖1 基于耳葉苔科psbA基因序列數(shù)據(jù)和UCLD分子鐘模型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) The phylogenetic tree of Frullaniaceae established from psbA gene sequences with uncorrelated lognormal distributed relaxed clock model 序列變異程度分析圖2 耳葉苔科D1蛋白各位點(diǎn)的熵值圖Fifure 2 Entropy plot for amino acid residues in D1 protein of Frullaniaceae 圖2為耳葉苔科D1蛋白各位點(diǎn)的熵值圖。熵值為零表示該位點(diǎn)高度保守，熵值越大說(shuō)明該位點(diǎn)發(fā)生的改變?cè)蕉啵儺惓潭仍礁?。由圖我們可以看出耳葉苔科psbA基因中大部分位點(diǎn)是高度保守的，只有少數(shù)的位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了改變。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，全長(zhǎng)為353個(gè)殘基的D1蛋白前體共有18個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異，%；其中有6個(gè)位點(diǎn)位于C末端的非功能區(qū)，該區(qū)域只存在于D1蛋白前體中，在成熟D1蛋白中被剪切除去[5]；其他12個(gè)變異位點(diǎn)則分散分布在D1蛋白的功能區(qū)中。這些變異位點(diǎn)的變異程度普遍較低（），只有位點(diǎn)30I和155T的變異度較高（）。 耳葉苔科psbA基因正選擇位點(diǎn)的鑒定 用PAML 、分支模型以及分支位點(diǎn)模型下的對(duì)數(shù)似然值和各參數(shù)估計(jì)值（表2）。在位點(diǎn)模型中，第一對(duì)模型M0M3用于檢測(cè)作用于各位點(diǎn)上的選擇壓力是否存在差異。模型M3的似然值?= ，模型M0的似然值?= ，似然比檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量2Δ ?=，.=P=95%，模型M3統(tǒng)計(jì)上顯著優(yōu)于M0（表3），由此可推斷耳葉苔科psbA基因各位點(diǎn)上經(jīng)受的選擇壓力顯著不同，即不同位點(diǎn)的ω值顯著不同。模型M2a以及M8的假定條件中均允許ω1，并同時(shí)檢測(cè)到同一個(gè)氨基酸位點(diǎn)，即155 T（P99%），受到正選擇，LRT檢驗(yàn)結(jié)果顯著。在分支模型中，通過(guò)比較自由比率模型和單比率模型共檢測(cè)出A、B、C三個(gè)分支可能發(fā)生正選擇 (圖1)。在分支位點(diǎn)模型中分別以這三個(gè)分支作為前景分支進(jìn)行分析，結(jié)果只在分支A和分支C檢測(cè)到一個(gè)正選擇位點(diǎn)：19 N。但在隨后的LRT檢驗(yàn)中，分支A和分支C的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量2Δ ，.=P=95%，檢驗(yàn)結(jié)果并不支持位點(diǎn)19N是一個(gè)統(tǒng)計(jì)上顯著的發(fā)生正選擇的氨基酸位點(diǎn)，推測(cè)可能是由于前景分支選擇壓力放松造成的假陽(yáng)性結(jié)果。表2 各類位點(diǎn)間可變?chǔ)乇戎的Ｐ拖碌膮?shù)估計(jì)值和對(duì)數(shù)似然值Table 2 Parameter estimates and loglikelihood values under models of variable ω ratios among sites模型Modelsnp似然值?參數(shù)估計(jì)值Estimated value of parameters正選擇位點(diǎn)Positive selection sites位點(diǎn)模型Site modelsM0（單一比值） M0：One ratio175ω= 無(wú) NoneM1a（近中性）M1a：Near neutral176p0=, ω0=P1=, ω1=不允許Not allowedM2a（選擇）M2a：Positive selection178p0=, P1=，P2= ω0=, ω1=ω2= 155 T**M3（離散）M3：Discrete179p0=, p1=, p2=ω0=，ω1=，ω2=155 T**M7（beta）M7：beta176p=，q=不允許Not allowedM8（beta amp。ω）M8：beta amp。ω178p0=，p=，q=, p1=，w=155 T**分支模型Branch models單比率（oneratio）175ω= 無(wú) None自由比率(freeratio)347ωA=，ωB=，ωC=無(wú) None分支位點(diǎn)模型Branchsite models分支a零假設(shè)A0Null model A0177p0=，p1=，p2a+p2b=，ω0=，ω1 = ，ω2 =不允許Not allowed備選假設(shè)AAlternative model A178p0= ，p1=，p2a+p2b=，ω0=，ω1=，ω2=19 N （）分支b零假設(shè)B0Null model B0177p0=，p1=，p2a+p2b=，ω0=，ω1=，ω2=不允許Not allowed備選假設(shè)BAlternative model B178p0=，p1=，p2a+p2b=，ω0=，ω1=，ω2=無(wú) None分支c零假設(shè)C0Null model C0177p0=，p1=，p2a+p2b=，ω0=，ω1=，ω2=不允許Not allowed備選假設(shè)CAlternative model C178p0=，p1=，p2a+p2b=，ω0=，ω1=，ω2=19N ()此外，位點(diǎn)模型檢測(cè)到大量的負(fù)選擇位點(diǎn)，說(shuō)明耳葉苔科植物的psbA基因非常保守。，表明凈化選擇在psbA基因的進(jìn)化過(guò)程中起主導(dǎo)作用。模型M2a和M8均允許位點(diǎn)受到正選擇作用，在統(tǒng)計(jì)上也顯著優(yōu)于它們各自對(duì)應(yīng)的空模型M1a和M7。%的位點(diǎn)受到負(fù)選擇的作用（ω=）。%的位點(diǎn)處于負(fù)選擇壓力下。所有的分析結(jié)果均支持耳葉苔科psbA在進(jìn)化上是高度保守的。表3 似然比值檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量（2Δ?）Talbe 3 Likelihood ratio statistics (2Δ?)模型比較Comparion2Δ ?2Δ ?自由度.位點(diǎn)模型Site modeM0 vs. M34M1a vs. M2a2M7 vs. M82M8 vs. M8a1分支模型Branch modelM0 vs. F172分支位點(diǎn)模型Branchsite modelA0 vs. A1B0 vs. B1C0 vs. C1.注：np表示模型中