【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 藏。 孢子直接接種的優(yōu)點(diǎn)： 孢子直接接種即所謂的一級(jí)接種工藝。目前大多是作為種子罐種子（二級(jí)種子）出現(xiàn)質(zhì)量問題或因生產(chǎn)中的突發(fā)事件而二級(jí)種子不能及時(shí)供應(yīng)時(shí)的一個(gè)補(bǔ)救措施。實(shí)際上孢子直接接種完全可以作為正常生產(chǎn)工藝使用，其優(yōu)點(diǎn)如下：直接接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液中孢子數(shù)與接進(jìn)種子罐的孢子數(shù)相同。則與二級(jí)接種所產(chǎn)生的生物量基本相當(dāng)，因?yàn)樵诜N子罐內(nèi)不會(huì)再繁殖新孢子。我國(guó)現(xiàn)用菌種，種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)配方基本一致，一級(jí)接種從孢子開始一直處于同一生長(zhǎng)條件，生長(zhǎng)環(huán)境隨孢子的成長(zhǎng)而變化，即始終為菌體生長(zhǎng)創(chuàng)造一個(gè)有利的環(huán)境。如培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件出現(xiàn)不可預(yù)見的異常因素，則孢子比菌球體更能適應(yīng)。能保持較幼的種齡，前期產(chǎn)酸稍慢，培養(yǎng)基pH＞，有利常數(shù)的充分糖化，后期產(chǎn)酸較快，后勁會(huì)較足，則殘?zhí)禽^低。減少一次接種操作也就減少一次染菌機(jī)會(huì)。同時(shí)節(jié)約了相應(yīng)設(shè)備的投資及能耗。但一級(jí)接種發(fā)酵前期，容易染菌，一旦發(fā)現(xiàn)染菌，或菌種出現(xiàn)質(zhì)量問題時(shí)，則培養(yǎng)基必須重新滅菌，而種子罐則靈活得多。當(dāng)然這種事故的概率很低，其次則是孢子在大罐生長(zhǎng)期的攪拌功率消耗問題。所以任何事物都不是絕對(duì)的。檸檬酸生產(chǎn)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子質(zhì)量的要求:(1)擴(kuò)培流程：國(guó)內(nèi)檸檬酸生產(chǎn)的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)普遍采用原種→斜面培養(yǎng)→三角麩曲培養(yǎng)→直接接入發(fā)酵罐發(fā)酵（2）斜面菌種的培養(yǎng):麥芽汁斜面制備，取麥芽粉加4倍質(zhì)量的水，在55~60℃下保溫糖化3h左右，時(shí)常攪拌，以碘液檢查黃色為終點(diǎn)。濾去麥芽渣，用水調(diào)至10176。Bx糖度，煮沸，再過濾一次，獲得澄清的麥芽汁。取少量澄清的麥芽汁加入20g/L瓊脂，裝入試管，擺成斜面，接入菌種，于35℃下培養(yǎng)7~8d，并做生產(chǎn)性能試驗(yàn)。（3）麩曲三角瓶培養(yǎng)A、麩曲培養(yǎng) 取新鮮麩皮，用60目篩子去細(xì)粉，以減少常數(shù)含量。按麩皮：水=1:~，拌勻至無干份無結(jié)團(tuán)想象。拌勻后，將裝入1000mL或2000mL三角瓶中，每只1000mL三角瓶裝濕麩皮約40g，2000mL三角瓶裝濕麩皮約100g。或用水洗麩皮表面，擠去水分，至手抓有水而不下滴為宜，按適當(dāng)量裝瓶。用8層紗布封扎瓶口，~60min，趁熱搖散，冷卻至35℃，培養(yǎng)1d。未發(fā)現(xiàn)氣味異?；蛉揪纯墒褂?。 在無菌室中，于無菌操作條件下，每一個(gè)三角瓶上接入1~2環(huán) 已活化好的斜面菌種孢子，或2ml斜面菌種的孢子懸浮液，于30~32℃下培養(yǎng)16~20h后，白色小菌落已蓋滿曲層表面，這時(shí)應(yīng)搖瓶一次，使培養(yǎng)基疏松、鋪平、繼續(xù)培養(yǎng)再經(jīng)4~6h，即約培養(yǎng)24h后，可看到培養(yǎng)基結(jié)成塊狀，白色菌絲生長(zhǎng)旺盛，但后停止。搖瓶時(shí)必須充分搖勻，使結(jié)塊的培養(yǎng)基疏散，鋪平后，繼續(xù)培養(yǎng)。待長(zhǎng)出的黑子孢子布滿豐盛后，即可使用。 此麩曲可直接作為種子罐種子，也可以作為二級(jí)種子，再擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大量為200倍，即一瓶麩曲可接種200只相同的三角瓶。B、麩曲質(zhì)量： ①孢子稠密、整齊、黑亮、無雜色孢子及氣生菌絲。 ②每批麩曲任取1~2瓶，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，將麩曲孢子接種于含14%深度薯干粉的500ml三角瓶中，裝液量為40ml，于轉(zhuǎn)速為200r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上，35℃下培養(yǎng)24h。下床測(cè)定費(fèi)（4）孢子懸浮液的制備： 將上述符合質(zhì)量要求的三角瓶麩曲，在無菌操作下，每瓶加入500~600ml無菌水，搖勻，切勿將棉塞打濕，在火焰下并美工或并入接種罐中。（5）發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源：碳源除了合成細(xì)胞物質(zhì)和提供維持生命的能量外，主要用于合成代謝產(chǎn)物（檸檬酸）。從檸檬酸生產(chǎn)角度看，葡萄糖、蔗糖、糊清是良好的碳源，工業(yè)上為降低生產(chǎn)成本，多采用廉價(jià)的甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜等。據(jù)報(bào)道，黑曲霉發(fā)酵中利用糖的有關(guān)酶系與糖濃度有關(guān)，糖深度低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)這些酶就少，它們處于飽和狀態(tài)。關(guān)于碳源的最適濃度，目前都認(rèn)為高糖濃度是檸檬酸發(fā)酵的一大特征。我國(guó)采用玉米粉的深層發(fā)酵，粉漿濃度為16%~20%,若采用淀粉質(zhì)的深層發(fā)酵粉漿濃度可達(dá)25%。氮源：氮源的作用是合成細(xì)胞物質(zhì)(蛋白質(zhì)，氨基酸，核酸，維生素等)和調(diào)節(jié)代謝，這是因?yàn)榧?xì)胞中銨離子濃度的升高，能解除ATP和檸檬酸對(duì)關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶的反饋抑制，使EMP代謝流量增強(qiáng)，有籃球檸檬酸生成與積累。經(jīng)試驗(yàn)證明，黑霉菌偏好于無機(jī)氮，當(dāng)有機(jī)氮和無機(jī)氮同時(shí)存在時(shí)，它首先利用無機(jī)氮。玉米培養(yǎng)基上NH4NO3 是最好的氮源，在無機(jī)氮中，生理酸性氮比堿性氮好，這是因?yàn)樯硭嵝缘械匿@離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長(zhǎng)階段結(jié)束，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，pH下降到較低水平有籃球檸檬酸的積累。所以銨鹽既可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制pH。另據(jù)報(bào)道，在檸檬酸發(fā)酵中途添加銨鹽，尤其是當(dāng)發(fā)酵中檸檬酸生成速率開始下降時(shí)，添加銨離子最為有利，它對(duì)菌體無影響。這種效應(yīng)可能是銨離子對(duì)檸檬酸積累調(diào)節(jié)作用有關(guān)。無機(jī)鹽：無機(jī)鹽是構(gòu)成微生物生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，在檸檬酸發(fā)酵中，有的構(gòu)成菌體，有的促進(jìn)代謝，有的促進(jìn)產(chǎn)酸，因此對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)和檸檬酸發(fā)酵具有重要的作用。尤其對(duì)國(guó)外采用的不耐金屬離子的檸檬酸產(chǎn)生菌，在發(fā)酵中控制微量金屬離子水平是極為重要的。然而無機(jī)鹽對(duì)檸檬酸發(fā)酵影響是十分復(fù)雜的，它因菌種、原料、生產(chǎn)方式不同而不同。我國(guó)采用誘變方法改良的菌種能耐很高的金屬離子，因此原料和水不經(jīng)過任何處理就可用于發(fā)酵。 黑曲霉對(duì)無機(jī)鹽及微量元素的要求要求KH2PO4含量/%KCL含量MgSO47H2O含量/%Zn2+含量/(mg/L)Mn2+含量/((mg/L)Cu2+含量/((mg/L)S含量/((mg/L)Fe2+含量/((mg/L)深層發(fā)酵~~~＜＜＜＜＜2 ②發(fā)酵條件的控制a 溫度：黑曲霉發(fā)本地檸檬酸溫度控制在28~30℃時(shí)，檸檬酸產(chǎn)率最高，發(fā)酵速度也最快，超過35℃時(shí)，雖初期產(chǎn)酸較高，但最終產(chǎn)酸低于15%以上。為了節(jié)約降溫能耗，我國(guó)在選育玉米發(fā)酵菌種時(shí)，有意地提高馴育溫度，故可在（37177。1）℃的條件下發(fā)酵，但超過42℃的時(shí)間過長(zhǎng)，則影響發(fā)酵，且雜酸生成較多。在正常情況下發(fā)酵過程中，發(fā)酵24h左右，%左右，隨著檸檬酸的積累，pH逐步下降，而草酸逐步被轉(zhuǎn)化，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總雜酸量為5~7g/L。b PH:發(fā)酵的最短Ph，分為起始和過程中的pH，實(shí)驗(yàn)證明：，發(fā)酵效果較好，低于此值效果下降。在玉米粉的檸檬酸發(fā)酵中，初始pH不加調(diào)節(jié)，為自然pH。當(dāng)接入菌種后，菌種生長(zhǎng)繁殖，消耗氮源和銨離子，使培養(yǎng)基的pH下降，前期（12h）pH下降較快，省略強(qiáng)的菌種培養(yǎng)12h，~,~。這時(shí)候會(huì)有少量的檸檬酸產(chǎn)生，但是由于發(fā)酵醪液固形物較多，原料成分繁雜，其中金屬離子含量較多，緩沖作用大，再加上檸檬酸是三個(gè)羧基的有機(jī)酸。當(dāng)檸檬酸產(chǎn)量和殘?zhí)呛恐偷扔诨蚪咏鹗歼€原糖時(shí)，才提高通風(fēng)量，迅速進(jìn)入產(chǎn)酸期，保證檸檬酸發(fā)酵的正常進(jìn)行。c 控制生物量：正常的發(fā)酵液中生物量應(yīng)控制在12~20g/L，過多的生物量會(huì)影響氧的溶解，增加發(fā)酵罐攪拌功率，且消耗了大量葡萄糖（一般認(rèn)為每增加1g生物量，要消耗1g以上的葡萄糖）。隨著培養(yǎng)液生物量的增加、溶氧也逐步降低，生物量的過度生長(zhǎng)，則檸檬酸的生成速率迅速下降。當(dāng)生物量過低，雖然溶氧較高，但檸檬酸的合成速度也較緩慢。以菌株體形式生長(zhǎng)的菌體，可限制生物體大量繁殖。對(duì)溶氧的影響也較菌絲形式的菌體低。d 嚴(yán)防缺氧：檸檬酸發(fā)酵是典型的好氧發(fā)酵，對(duì)氧十分敏感。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸期只要有幾分鐘的缺氧時(shí)間，就會(huì)對(duì)發(fā)酵造成嚴(yán)重影響，甚至完全失敗。但生產(chǎn)中不可抗拒的意外事故，在所難免。遇到停電或因設(shè)備故障而造成通風(fēng)中斷時(shí)，要采取緊急措施:關(guān)閉進(jìn)出空氣閥。迅速啟動(dòng)備用電源恢復(fù)供氣；防止發(fā)酵罐中料液逆流到空氣過濾器中；用滅菌后的CaCO3 ~，然后恢復(fù)正常操作。如事故發(fā)生在發(fā)酵液pH＞，恢復(fù)期較快，產(chǎn)酸稍有影響，恢復(fù)期會(huì)拖長(zhǎng)到10余小時(shí)，甚至難以恢復(fù)。f 通風(fēng)量： 檸檬酸發(fā)酵通風(fēng)量相對(duì)來說不大。通風(fēng)量不是一個(gè)固定值，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的質(zhì)量、菌種生長(zhǎng)需要、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)及其攪拌漿的型式和周線速度以及罐壓而定。一般規(guī)律是發(fā)酵罐容積越大、培養(yǎng)液層越厚、攪拌轉(zhuǎn)速越快則通風(fēng)量越小。通風(fēng)量過大菌體過早進(jìn)入衰亡期，也不利于CO2的固定，且動(dòng)力浪費(fèi)過多。氧的溶解與攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓成正比關(guān)系；與溫度和培養(yǎng)基粘度成反比關(guān)系。三、檸檬酸發(fā)酵染菌的防治檸檬酸發(fā)酵常見的污染菌：檸檬酸發(fā)酵初期，即發(fā)酵液pH，常見的污染菌為細(xì)菌、酵母、曲霉及青霉菌等，隨著發(fā)酵液pH的下降，大多數(shù)細(xì)菌和曲霉被抑制或自溶，而耐酸性的酵母和青霉菌等繼續(xù)繁殖，重者導(dǎo)致發(fā)酵倒罐，輕者產(chǎn)酸很低且粘度增加，提取困難。污染菌的檢查：大部分被污染的發(fā)酵液可以從發(fā)酵液的異常情況來檢出，如色度、異味，變稠或稀、生產(chǎn)菌球散開、菌絲變形、產(chǎn)酸不正常甚至不產(chǎn)酸或“倒酸”、而糖卻大量消耗等。防、治染菌措施：解決發(fā)酵工業(yè)的染菌問題，不言而喻，應(yīng)以防為主。只有防得嚴(yán)才能消除或降低染菌因素。疏于防而重于治則必事倍而功半。（1）防止染菌措施：①嚴(yán)格無菌操作制度；②加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理；③重視設(shè)備管理，保持高的設(shè)備完好率；④保證無菌空氣質(zhì)量；⑤嚴(yán)格保證菌種質(zhì)量。（2）搶救染病措施：①細(xì)菌污染醪的處理：發(fā)酵前期污染細(xì)菌，可加大通風(fēng)量，使發(fā)酵迅速轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，細(xì)菌可被抑止或自溶死亡（含米曲霉菌）。 發(fā)現(xiàn)較遲，染菌較重，要立刻加檸檬酸母液或濃鹽酸、硫酸等而等將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)到＜。如細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，本菌較少（某些細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素能抑制或溶解黑曲霉菌體），~，重新按常規(guī)消毒。再一級(jí)接種，或與正常發(fā)酵罐（產(chǎn)酸＞6%）相互混合繼續(xù)發(fā)酵，但必須謹(jǐn)慎使用，防止“兩敗俱傷’.②酵母污染醪的處理：這是檸檬酸發(fā)酵最難處理的染菌事故，野生酵母即使在pH＜，照樣生長(zhǎng)。 早期發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基稍有異味而總糖消耗不多，~，間接加熱至90℃重新滅菌，一級(jí)接種繼續(xù)發(fā)酵。如已產(chǎn)酸但不高，~，間接滅菌，重新一級(jí)接種發(fā)酵。后期污染酵母，如產(chǎn)酸已達(dá)到可提取程度，可提前加熱滅菌后放罐提到。如產(chǎn)酸不高但還原糖尚有可繼續(xù)發(fā)酵的量時(shí)，可采取提高培養(yǎng)溫度至39~40℃，~,即50m3發(fā)酵罐加1~，加快產(chǎn)酸速度，減少損失。③污染曲霉及青霉的處理：如污染米曲霉，當(dāng)pH＜。如污染青霉則危害極大，這些雜菌能在低pH醪中生長(zhǎng)，結(jié)果使醪變稠、變黃、粘度增大，嚴(yán)重影響氧的傳遞， 導(dǎo)致發(fā)酵失敗，甚至“倒罐”。對(duì)付這種污染的措施：早期發(fā)現(xiàn)，可另補(bǔ)充一些新培養(yǎng)基，~，重新滅菌，一級(jí)接種發(fā)酵。四、物料衡算：缺失設(shè)備選型V—發(fā)酵液體積m3G1—設(shè)備身體的重量kgC1—設(shè)備身體的比熱容【kj(m3*h)】Q最大={247。25+2545} 247。=58766kg/(m3*h)發(fā)酵罐空罐滅菌蒸汽用量（1）查表得hb=40Mn,取D:H=1:4 200=πD2[HD+2（hb+D247。6）247。4=13πD3247。12+解得：D= H=橢圓封頭的體積：V=πD2（hb+D247。6）247。4= m3封頭厚度：ξ=Pi247。(2[a]) =1000247。 (2105)=24mm查表得，封頭重量為：3128kg內(nèi)壓圓筒厚度：δ=PDi247。(2[a]tP)+G1+G2 =3900247。(2105) = 取24mm 查表得，1m高筒節(jié)鋼板重量為：發(fā)酵罐罐體重量為：=36233kg發(fā)酵罐重量為：42597kg 列管換熱面積比為 1:h列管=200247。（108π247。1000）=708m查表得，列管的重量為7264kg(), 蒸汽滅菌，由20℃升到125℃，其蒸氣量為：（42597+7264）（12520）247。（2718125）=1192kg(2)填充發(fā)酵罐空間需的蒸汽量。 D空=200=(3)滅菌過程的熱損失：輻射與對(duì)流聯(lián)合給熱系數(shù)a, 罐外壁溫度70℃ a=+（7020）=200m3發(fā)酵罐表面積為：S=4πR2+2πRH=4π(247。2)2+=239 m3