【文章內容簡介】 所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。 ③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。二、進樣器 早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2．停流進樣?？杀苊庠诟邏合逻M樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)鬼峰；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（%），操作方便。 六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環(huán)體積的50%（最多75％），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環(huán)體積的5~10倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。 六通閥使用和維護注意事項：①amp。micro。m濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。4．自動進樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。三、色譜柱 色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。 柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。1．柱的構造 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，~20amp。micro。m(5~10amp。micro。m)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。 色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱），內徑2~5mm（，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semimicrocolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），~；④半制備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。2．柱的發(fā)展方向 因強調分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3amp。micro。m。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、（microbore）。細管徑柱的優(yōu)點是：①節(jié)省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現(xiàn)LCMS聯(lián)用。 但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100amp。micro。l/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。3．柱的填充和性能評價 色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20amp。micro。m時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20amp。micro。m時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。 必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結構是否合理。 無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在177。5%或177。10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。 一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。4．柱的使用和維護注意事項 色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。 ①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。 ②　應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?③　一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。 ④　選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。 ⑤　避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。 ⑥　經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。 下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200amp。micro。l四氫呋喃數(shù)次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。 陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。 ⑦　保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。 ⑧　色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。 柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。 通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。 每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。高壓液相色譜HPLC培訓教程(五) 四、檢測器 檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變?yōu)殡娦盘枴PLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。1．分類1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應。3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。2．性能指標1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mVml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mVs/g。3）檢測限(detection limit) 檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。 檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度注意與分析方法檢測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。 檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。4）線性范圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的最大與最小的范圍表示，例如Waters 996 ~。 定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關系。輸出信號與樣品量最好呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但