【文章內(nèi)容簡介】 成5l176。B233。豆汁1000mL(多則濃縮，少則補(bǔ)水)。 (2)As3．350黑曲霉涪養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基或10％豆芽汁培養(yǎng)基。 豆芽汁培養(yǎng)基制法：取大豆芽100g加水1L，煮沸30min，過濾濾汁補(bǔ)水到1L，另加葡萄糖或蔗糖5％、瓊脂2％即成。 、2．滅菌 100kPa(表壓)滅菌30min后擺斜面。3．接種培養(yǎng)接種后置30℃，恒溫箱3d即成，4．菌種保藏4℃冰箱，3—4月移接一次。純種三角瓶培養(yǎng)(一)原料配比(1)麩皮 80g 面粉20g 水80一90g(2)麩皮 85g 豆餅粉15g 水95mL左右 (二)滅菌 原料混合拌勻后分裝寸：已經(jīng)干熱滅菌的250mL的三角瓶中，每瓶約裝濕物料l0—15g(使其厚度為1cm)，以100kPa滅菌30min，冷卻后備用。 (三)接種培養(yǎng) 接種兩環(huán)斜面菌種孢子于已冷卻的三角瓶中格勻，在30℃土1℃的恒溫箱中培養(yǎng)13—20h，至菌絲生長后搖動一次，再培養(yǎng)4—6h再搖一次，繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲充分生長，形成結(jié)餅狀即可扣瓶(以手將三角瓶扣翻)。使底部曲料能充分接觸空氣，促使米曲霉繼續(xù)生長發(fā)育，全程約需3d。 (四)應(yīng)用 剛培養(yǎng)好的新鮮三角瓶擴(kuò)大曲，發(fā)芽力強(qiáng)，發(fā)芽率高，應(yīng)及時使用。如果需要保存，可放置在4℃冰箱中，但時間不宜超過10d。 (五)三角攜種曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 孢子發(fā)育肥狀、整齊、稠密、布滿曲料，頂囊肥大；米曲霉呈鮮艷黃綠色、黑曲霉呈黑褐色、無異味、無雜菌、內(nèi)無白心、有多種曲霉固有的香味，必要時可測定孢子數(shù)和檢查雜菌數(shù)。種曲制造 (一)種曲制造的目的和要求 種曲是醬油大曲的種子，米曲霉要求孢子數(shù)每克60億以上(干基)，把子發(fā)芽力強(qiáng)，發(fā)芽串達(dá)90％以上，而且純粹度高，細(xì)菌數(shù)不超過107個／g。 (二)種曲空及其主要設(shè)施 種曲空是培養(yǎng)種曲的場所，要求密閉性能或保溫保濕性能好，便于消毒滅菌，使種曲有一個既衛(wèi)生又符合生長繁殖所需要的環(huán)境。種曲空的大小為5m4m3m，四周為水泥墻，上為圓弧形房頂，以防止冷凝水下滴影響種曲的質(zhì)量。種曲室需具備門、窗、天窗，并有調(diào)溫調(diào)濕設(shè)施和排汽裝置。 其他主要設(shè)備有：蒸料鍋、接種混合桶、振蕩篩及揚料器等。培養(yǎng)用具有：木盤(45cm40cm5cm)或竹困(直徑90cm左右)。鋁盤(50cm85cm4cm)。2．滅菌工作 種曲制造必須盡量防止雜菌污染，因此曲室及一切工具有使用前均需經(jīng)消毒滅菌。 曲室滅菌—般1m3用硫碘25g或甲醛10mL，甲醛對酵母及細(xì)菌有較強(qiáng)的殺傷力。硫磺對霉菌有較好的殺菌效果，二者交替使用，效果更為顯著。其他用具可用蒸汽滅菌，或75％酒精擦洗，也可用0．2％甲醛水溶液擦洗滅菌。配方如下：(1)麩皮85g 豆餅15g 水90mL(2)麩皮80g 面粉20g 水70mL 原料混合后過L 5目篩一次，堆積潤水。常壓蒸料時間約為2bl加壓蒸科，需100kPa(表壓)維持30一60min，出鍋后攤冷，水分含量為50％一54％。 也可采用二次潤水法，即先加水40％一50％加水45％。4．接種夏天溫度為38℃左石，冬天42℃左右，接種量為0. 3％一0．5％，接種后迅速拌勻。 接種后的曲料即可裝匾培養(yǎng)，由于各地區(qū)各廠的設(shè)備條件不同而不同，其操作方法也各不相同現(xiàn)以竹匾制曲法為例簡介如下： 將接種后的曲料故入竹匾內(nèi)，輕輕攤平，厚度約2cm，移入種曲室內(nèi)培養(yǎng)。保持溫度28—30℃，培養(yǎng)16h左右，曲料上呈現(xiàn)白色菌絲，同時產(chǎn)生曲香味，品溫升高到38℃左右，此時即可翻曲，翻曲前先換曲室空氣一次。翻曲時要把曲塊捏碑，再補(bǔ)加40 c2E有溫水，可利用噴霧器徐徐噴灑，補(bǔ)水量約為種曲原料的20％一40％。噴水完畢，用篩子過篩使水分均勻，然后分匾攤平，每匾厚度在1cm以下，卜蓋濕紗布一塊，使曲料與空氣不直接接觸，以便保持足夠的濕度。敵曲后，種曲室內(nèi)一般維持室溫26—28℃，品溫為31—38℃，干rV溫度相差1—2℃，此時菌絲大量生氏繁殖，翻曲4—6h后，肉眼可見到白色菌絲體。這一階段必須嚴(yán)格注意曲料品溫的變化，隨時調(diào)整室溫及竹匾上下放置的位置，使品溫不超過38℃。并經(jīng)常保持紗布的潮濕，如溫度過高，需開啟門窗降溫；溫度過低，則用蒸汽保溫．這是制好種曲的關(guān)鍵所在。再經(jīng)10h左右，曲料上已全部呈淡黃綠色，品溫逐漸下降至32—35℃，至70L左右，孢子大量繁殖呈黃綠色，即制成種曲。目前，北京、天津的部分廠已用通風(fēng)曲箱制造種曲。 6．種曲的干燥和保藏 各廠自制種曲，以使用新鮮種曲為宜，盡量按計劃隨做隨用，由于種曲水分較高，不宜長期保藏，當(dāng)氣溫較高時，因繼續(xù)新陳代謝，造成孢子衰老死亡，并使孢子發(fā)芽率降低，而且又極易被雜菌污染。對暫時不用的種曲，經(jīng)40一45℃熱風(fēng)干燥。水分控制在12％以下，可做短期保藏。7．種曲制造過程中注意事項(1)種曲室應(yīng)經(jīng)常保待清潔衛(wèi)生，必要時需徹底消毒滅菌(2)所有設(shè)備和用具使用后要清洗干凈，并妥善保管。(3)原料要新鮮，數(shù)量要準(zhǔn)確，熟料力求疏松。(4)嚴(yán)格按工藝操作要求生產(chǎn)，控制好溫度、濕度。(5)使用高壓鍋蒸料時要注意安全。(6)加強(qiáng)生產(chǎn)聯(lián)系，保證使用新鮮種曲。(7)要加強(qiáng)對種曲質(zhì)量的檢杏并做好記錄(8)培養(yǎng)好的種曲要保藏在低溫干燥處。五、種曲質(zhì)量檢驗1．外觀孢子旺盛，米曲霉呈新鮮黃綠色，有各種種曲特殊香氣、無夾心，無根霉或青霉等其他異色。2．孢子數(shù)用血球計數(shù)扳測定米曲霉種曲，孢子數(shù)應(yīng)在60億／g(干基計)以上。3．細(xì)菌數(shù)米曲霉種曲細(xì)菌數(shù)不超過107個／g4．發(fā)芽率 必要時用懸滴培養(yǎng)法測定發(fā)芽率，要求達(dá)到90％以上。如發(fā)現(xiàn)有問題，要認(rèn)真查哪個環(huán)節(jié)出現(xiàn)，必要時從試管原菌開始，重新制造種曲。第五節(jié)制 曲 制曲是我國發(fā)酵工業(yè)傳統(tǒng)技術(shù)，對醬油發(fā)酵而言，制曲則是醬油發(fā)酵的主要工序，制曲過程的實質(zhì)是創(chuàng)造曲霉生長最適宜的條件。保證優(yōu)良曲霉菌等有益微生物得以充分發(fā)育繁殖(同時盡可能減少有害微生物的繁殖)，分泌醬油發(fā)酵所需要的各種酶類。這些酶不僅使原料成分發(fā)生變化，而且也是以后發(fā)酵期間發(fā)生變化的前提。種曲質(zhì)量的好壞，不但影響原料利用率，而且也影響淋油效果和醬油質(zhì)量。要制好曲，首先要掌握曲霉的生理特性和生產(chǎn)規(guī)律，這是菌體本身的遺傳性能所決定的，其次是要有適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件。在制曲過程中，掌握好溫度、濕度是制好曲子的關(guān)鍵。生產(chǎn)用的曲霉及其酶系特性 (一)生產(chǎn)用的曲霉——米曲霉 目前國內(nèi)多采用米曲霉及其變種作為醬油發(fā)酵的生產(chǎn)曲霉．主要菌種為滬釀3. 042(它是50年代后期由福建省永春地區(qū)挑選出來的良種米曲霉，當(dāng)時在中科院的編號為As3，863，后經(jīng)上海釀科院改良為滬釀3．042)。它具有豐富的酶系，酶活力較高，能夠使醬油產(chǎn)生獨特的香氣與口味。 (二)米曲霉產(chǎn)生的曲系特性 米曲雷的酶系中，通常可以分為胞外酶和胞內(nèi)酶兩大類。胞外酶是細(xì)胞產(chǎn)生并分泌于細(xì)胞外面進(jìn)行作用的酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶，谷氨酰胺酶等水解兩類；而胞內(nèi)酶是細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)內(nèi)部起作用的酶，如氧化還原酶等。 1．酶系對溫度敏感性的差異 低鹽固態(tài)發(fā)酵周期一般較短(10一30d)，為了在短時間內(nèi)完成對原料的分解作用，只能提高發(fā)酵溫度。根據(jù)化學(xué)反應(yīng)速度與溫度的關(guān)系，溫度越高，酶反應(yīng)的初速度越快，因酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，一般在40℃以上就開始受到破壞，其破壞的程度隨著溫度的增高而加劇。米曲酶產(chǎn)生的酶系中，陳淀粉酶耐熱性較高外，其他兩類對熱都很敏感，特別是肋酶和谷氨酰胺酶，在50一55℃情況下，將很快失活。 2．發(fā)酵狀態(tài)對酶系的影響 低鹽固態(tài)發(fā)酵，由于醬醅內(nèi)部粘性大．流動性差，保溫時池底或四壁的高溫加速了酶的失活．不利于酶作用的發(fā)揮。在稀醪發(fā)酵中，水解酶可充分發(fā)揮作用。使分解產(chǎn)物濃度較大，從而為轉(zhuǎn)化酶類與合成酶類反應(yīng)速度的增加提供了物質(zhì)條件。 由于pH值改變了底物的配分子的帶電狀態(tài)，所以氫離子濃度對酶反應(yīng)速度影響很大，又由于各種酶都有持定的最適PH值，大于或小于這個值。酶活力就要降低，甚至引起酶蛋白質(zhì)的變性而喪失活力。 醬油曲中的中性蛋白酶的最適PH值為7．2左右，日本配制醬油，采用前期低溫發(fā)酵(溫度控制在15℃左右)，這樣就控制乳酸菌的生長繁殖，醬醅PH值不致下降太快，從而更好地發(fā)揮了中性蛋白酶與堿性蛋白藥對原料中蛋白質(zhì)的分解作用。我國目前采用的低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝發(fā)酵溫度較高(一般控制在40一45℃)，乳酸菌的繁殖使醬醅的pH值下降過快，影響了中性蛋白酶和堿性蛋白藥的作用，如果適當(dāng)添加酸性蛋白酶將有助于醬油質(zhì)量的提高。 4．食鹽對酶促反應(yīng)的影響 食鹽對蛋白酶的使用試驗，是將曲的提取液(或液體發(fā)酵濾液)配成不同濃度的食鹽溶液取該溶液與酷蛋白質(zhì)混合，置于40℃水浴中酶解一段時間，測定其酶活力后，繪制食鹽濃度一酶活曲線(如圖2—1—12)。 下圖說明食鹽作為單因子條件，低濃度時對蛋白酶有激活作用，隨著食鹽濃度的增加反而對蛋白酶產(chǎn)生抑制作用，并隨著食鹽濃度的增加抑制作用明顯，它對蛋白酶的抑制為不可逆抑制。二、影響曲霉菌生長和酶形成的因素制曲的目的就是創(chuàng)造最適宜的條件，保證曲霉菌大量繁殖，產(chǎn)生醬油發(fā)酵需要的各種酶系，別是蛋白酶和淀粉酶(液化型和糖化型)。 酶存在于一切生物細(xì)胞中，有些酶類在細(xì)胞表面的質(zhì)膜上活動(各呼吸酶)，大多數(shù)酶則在細(xì)胞原生質(zhì)內(nèi)活動，有關(guān)發(fā)酵用的酶類在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以可溶性狀態(tài)存在。 曲霉菌屬真核細(xì)胞，它的細(xì)胞由細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁等部分組成。曲霉的菌絲體由多細(xì)胞組成，具有產(chǎn)酶功能，菌絲體生長繁殖的好壞，直接影響酶的形成‘ 制曲原料的配比、制曲的工藝方法、制曲過程中的溫度、濕度以及制曲周期，是影響曲霉生長與酶形成的主要因素。 (一)制曲原料 原料是釀制醬油的基礎(chǔ)，它的種類、質(zhì)量及配比對制曲有直接影響。并決定著醬油的產(chǎn)率與質(zhì)量。因此制曲原料，既要以米曲霉能正常生長繁殖為前提，又要考慮到醬油本身質(zhì)量的需要，故原料應(yīng)符合價格低、來源廣、宜于制曲、曲酶活力強(qiáng)等條件。 (二)濕度 通風(fēng)制曲過程中水分揮發(fā)較多，因此要求曲料含有適當(dāng)?shù)乃?。因為制曲初期水分含量對米曲霉的孢子發(fā)芽有極其重要的影響，水分過少，曲霉因缺水而生長不好。各類微生物的生長繁殖都有其極小的水分活性，即繁殖的界限水分。如曲霉Aw＝0．85酵母Aw＝0．88乳酸菌Aw=0．9l枯草桿菌Aw＝0．95 曲料初期的水分含量較多，又由于制曲周期較短(如24—26h)，為了在較短的周期內(nèi)使蛋白酶活力達(dá)到高峰，溫度常較高，所以容易導(dǎo)致細(xì)菌大量繁殖，黑根霉、毛霉也因此易在薄層曲的表面生長。除曲料含水量要控制外，曲室也要控制一定的相對濕度。 (三)溫度與時間 曲霉生長的最適溫度是30一37℃、40℃時生長緩慢．至42℃時停止生長，45℃時開始死亡。 制曲初期，如品溫保持在25—28℃，可以抑制枯草桿菌的繁殖，待曲霉繁殖旺盛后，前者即不易繁殖。但若溫度過低，曲霉菌生長受到抑制，小球菌就會大量繁殖；同時，水分含量大時，更利于青霉菌的生長。 溫度及制曲周期對米曲霉各酶系的形成有明顯的影響，廣州市調(diào)味品研究所采用不同制曲溫度與制曲時間，測定幾種酶的話力，見表2—1—11，專2—1—1表2—1—13。 實驗數(shù)據(jù)表示： (1)米曲霉的蛋白酶活力受培養(yǎng)溫度影響。25—35℃時酶活力最高，培養(yǎng)于35℃時顯著降低。培養(yǎng)時間延長，各類蛋白藥活力大多能提高。 (2)制曲溫度高，糖化酶活力高。低溫制曲雖然位糖化酶活力不及高溫曲高．但蛋白酶活性高，同時制曲過程中淀粉消耗少。因低溫曲蛋白酶活力高，釀成的醬油較澄清。蛋內(nèi)質(zhì)利用率、氛基酸生成率及淀粉利用率均較高溫曲高。因此，主張通風(fēng)制曲宜采用兩級溫度，前期(接種12h以前)品溫可控制稍高于30℃，以促使孢子萌發(fā)和菌絲生長，后期(12h以后)品溫宜控制在30一26℃。 (3)米曲霉在30℃左右培養(yǎng)48h，氧化酶活力高。溫度太高(35c以上)或太低(25C以下)都會影響氧化晦活性的增長。 (4)米曲酶培養(yǎng)溫度和時間對谷氨酰胺酶的產(chǎn)生影響很大。高溫短時間培養(yǎng)，谷氨酰胺酶活性低；用較低的溫度，并適當(dāng)延長制曲時間，則可使谷氨酰胺酶活力提高。 (四)通風(fēng) 米曲霉乃好氣性曲霉，繁殖旺盛期，產(chǎn)生的CO2量與菌體的生成量成正比，所以通風(fēng)是必要的。但太大會導(dǎo)致細(xì)菌(如小球菌)大星的繁殖，太小又會促使短球菌大量繁殖，甚至在通風(fēng)不良處，會造成嫌氣性梭菌的繁殖，這些梭菌易產(chǎn)生酪酸臭，影響風(fēng)味。另外，如果枯草桿菌大量侵入，還能引起腐敗臭、氨臭。因此，通風(fēng)量的控制是制好曲的主要出素之一。為f創(chuàng)造均勻而良好的通風(fēng)條件，必須做到堆積疏松及平整。翻曲可使曲料疏松，減少通風(fēng)阻力，保持較均勻的曲料水分及溫度，所以翻曲也是控制合理通風(fēng)的主要手段之一。 (五)原料細(xì)度 原料粉碎的越細(xì)，表面積越大，曲霉繁殖接觸的面積越大。分解效果越好，原料利用率越高。但如果原料粉碎的太細(xì)，而且輔料比例偏低，則潤水時容易結(jié)塊，致使制曲時通風(fēng)不暢而影響成曲質(zhì)量。三、霉菌在曲料上的生長空化 (一)孢子發(fā)芽期 曲料接種后，米曲霉孢子吸水后開始發(fā)芽、接種后最初4—5h，曲霉迅速生長繁殖，形成生長優(yōu)勢，對雜菌可起到抑制作用。這一時期的主要因素是水分和溫度。水分適當(dāng)，孢子即吸水膨脹，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)被水溶解后利用，為后期的活動提供了條件。一般來說，溫度低干25℃，發(fā)芽緩慢，在水分又大的情況下，小球菌可能大量繁殖，溫度高于38C，泡不適宜孢子發(fā)芽，卻會適合枯草桿菌生長繁殖，霉菌最適發(fā)芽溫度為30℃左右，生產(chǎn)上一般控制在30一32℃。 (二)菌絲生長期 孢子發(fā)芽后，菌絲生長，品溫