【文章內(nèi)容簡介】 血紅素內(nèi)源性合成代謝途徑中的一種前體，其化學結構如圖2[22]所示。細胞內(nèi)的PpⅨ是一種很強的光敏物質(zhì)，最大吸收峰值位于630 nm，光敏毒副反應小，是重要的光動力治療藥物。PpⅨ是一種非常有效的光敏劑，它在一定波長的光照射下，發(fā)生化學反應， 產(chǎn)生單重態(tài)氧和氧化物， 引起細胞膜、線粒體和核酸的損傷，使病變細胞壞死、凋亡，從而起到治療疾病的作用[17]。圖1 ALA體內(nèi)代謝途徑 metabolic pathway of ALA in vivoB圖2. 聲敏劑分子結構 A. ALA B. 原卟啉IXFig. 2 Molecular structure of sonosensor A. ALA IX A 1989 年Umemura 等通過在體和細胞的實驗研究表明，血卟啉介導的超聲治療比單純的超聲誘導腫瘤細胞壞死明顯增多，由此首次提出了聲動力治療的概念[18]。其機理可能是主要地與超聲的空化作用激活聚集在癌組織的血卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧，引起病變組織細胞的壞死和凋亡。2002年Arakawa K等研究了聲動力治療用于兔股動脈置入支架后再狹窄預防作用[19]，而聲動力治療對動脈粥樣硬化斑塊的作用的研究目前國內(nèi)外未見報道。 3. ATP 三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是一種核苷酸，作為細胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。 機體內(nèi)ATP生物學作用 三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是一種核苷酸，作為細胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。人體每天的能量需要水解100150摩爾的ATP即相當于50至75千克。這意味著人一天將要分解掉相當于他體重的ATP。所以每個ATP分子每天要被重復利用10001500次。ATP不能被儲存，因為ATP的合成后必須在短時間內(nèi)被消耗。 ATP還可作為能源物質(zhì)。肌肉中儲藏著多種能源物質(zhì)，主要有三磷酸腺苷（ATP）、磷酸肌酸（CP）、肌糖原、脂肪等。 ATP亦參與能源物質(zhì)的代謝：（一）無氧代謝：劇烈運動時，體內(nèi)處于暫時缺氧狀態(tài)， 在缺氧狀態(tài)下體內(nèi)能源物質(zhì)的代謝過程，稱為無氧代謝。它包括以下兩個供能系統(tǒng)。 ①非乳酸能（ATP—CP）系統(tǒng)—一般可維持10秒肌肉活動 無氧代謝 ②乳酸能系統(tǒng)—一般可維持1~3分的肌肉活動 非乳酸能（ATP—CP）系統(tǒng)和乳酸能系統(tǒng)是從事短時間、 劇烈運動肌肉供能的主要方式。ATP釋放能量供肌肉收縮的時間僅為1~3秒， 要靠CP分解提供能量，但肌肉中CP的含量也只能夠供ATP合成后 分解的能量維持6~8秒肌肉收縮的時間。因此， 進行10秒以內(nèi)的快速活動主要靠ATP—CP系統(tǒng)供給肌肉收縮時的能量。 乳酸能系統(tǒng)是持續(xù)進行劇烈運動時，肌肉內(nèi)的肌糖元在缺氧狀態(tài)下進行酵解， 經(jīng)過一系列化學反應，最終在體內(nèi)產(chǎn)生乳酸，同時釋放能量供肌肉收縮。 這一代謝過程，可供1~3分左右肌肉收縮的時間。 　　(二)有氧代謝：是在氧充足的條件下，肌糖元或脂肪徹底氧化分解，最終生成二氧化碳(Co2)和水(H2O)， 同時釋放大量的分解代謝，稱為有氧氧化系統(tǒng)。 ATP與“findme”信號 人體內(nèi)每一天都會更新數(shù)以億計的細胞，而這種快速的、有效地、免疫的清除死亡細胞的方式需要通過吞噬細胞選擇性識別、吞噬凋亡細胞來實現(xiàn)。近期研究表明一類由凋亡細胞釋放的可溶性介質(zhì)在趨化吞噬細胞中起到了重要作用，而這種介質(zhì)我們稱之為“findme”信號。這些信號包括溶血磷脂酰膽堿、趨化因子、ATP、UTP、S1p等等。其中ATP等確認可以在體內(nèi)環(huán)境下，起到對單核細胞的吸引作用，因此“findme”信號這一概念證實了凋亡細胞確實對趨化吞噬細胞有積極地作用[12]。 ATP與caspase凋亡細胞釋放核苷酸依賴于caspase途徑的調(diào)節(jié)功能。在誘導細胞凋亡之前加入caspase抑制劑zVADfmk后所取上清液不能夠誘導單核細胞聚集，證明凋亡細胞釋放的ATP依賴于caspase途徑并受其調(diào)節(jié)[13]。 前 言動脈粥樣硬化是一種與多種危險因素有關的復雜疾病，炎癥是其發(fā)生發(fā)展重要的病理生理機制之一，炎癥細胞在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)大量浸潤會導致斑塊的不穩(wěn)定，而不穩(wěn)定斑塊的破裂恰恰是許多急性心血管事件的觸發(fā)點。聲動力治療是通過超聲誘導聲敏劑來殺傷細胞的新方法，但是在聲動力治療巨噬細胞后死亡的巨噬細胞及斑塊內(nèi)堆積的脂質(zhì)需要趨化更多的單核細胞進入斑塊進行清除，才能達到改善斑塊內(nèi)的炎癥環(huán)境的目的。本研究用transwell方法證明聲動力治療后的巨噬細胞上清能夠趨化單核細胞，而且這種趨化能夠被ATP酶部分的抑制。用熒光素酶法，證明聲動力治療巨噬細胞后細胞內(nèi)及釋放到上清中的ATP增多，而在抑制了caspase途徑凋亡后，這種增多的趨勢減弱。本研究驗證了聲動力治療巨噬細胞能夠趨化單核細胞，并探討了ATP在趨化過程中的作用，對聲動力治療動脈粥樣硬化的機制進行了有益的探索，并為動脈粥樣硬化的治療提示了一個可能的新方向。 材料與方法1. 實驗對象THP1,人急性單核細胞白血病細胞系， 中科院上海細胞庫2. 試劑與儀器 5氨基酮戊酸（ALA） 天豐生物科技有限公司，西安牛胎血清，RMPI1640培養(yǎng)基 Hyclone化學公司，北京青霉素G，鏈霉素 Beyotime生物技術，江蘇12十四酸佛波酯13乙酸鹽（PMA） Darmstad公司，德國ATP檢測試劑盒 碧云天生物技術有限公司， 上海ATP酶 碧云天生物技術有限公司，上海臺盼藍 碧云天生物技術有限公司， 上海N苯甲基氧化碳酰纈氨酸丙氨酸天冬氨酸氯化丙酮(zVADfmk)BioVision公司，美國Transwell Corning公司，美國Luminometer Thermo 公司，美國 Corning公司，美國IX 71型熒光顯微鏡 Olympus公司，日本3. 實驗方法 細胞培養(yǎng)THP1（人急性單核白血病細胞系）作為實驗用細胞系。使用添加有10%胎牛血清和50μg/ml的青霉素G鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基孵育THP1細胞。將培養(yǎng)基保存在37℃、含5%CO2和95%空氣的保濕孵育器內(nèi)，當發(fā)生聚集時進行傳代培養(yǎng)。實驗時，并加入添加有濃度為10μg/ml PMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時即成為巨噬細胞。 SDT治療，孵育2小時后，用頻率為1MHz，,之后以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩次，加入無血清細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 Transwell取SDT后6小時細胞上清、對照組細胞上清、ATPase組及SDTATPase組細胞上清，分別加入transwell板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為106/ml的單核細胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，對下層細胞進行臺盼藍染色，用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細胞數(shù)。 熒光素酶法檢測細胞上清及細胞內(nèi)ATP 取SDT后20min、對照組、zVADfmk組及SDTamp。zVAdfmk 組細胞上清及細胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測工作液當中，反應10s后使用luminome