【文章內(nèi)容簡介】 ? polymorphisms can be identified by EMC in DNA–DNA heteroduplexes. ? T4 Endo nuclease VII ? samples are PCR amplified, denatured and hybridized to create DNA–DNA heteroduplexes ? Enzymes cleave adjacent to the mismatch and products are resolved via gel or capillary electrophoresis. ? the cleavage enzymes often nick plementary regions of DNA as well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces the pooling capacity of the assay) RFLPRestriction Fragment Length Polyhmorphism RFLPs Microsatellite repeats 差異顯示技術(shù) (mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRTPCR) 在不同的生長時期、在個體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對疾病的反應(yīng)以及不同的環(huán)境下調(diào)控基因的表達(dá)是不同的，這就是基因的差別表達(dá)（ differential expression）。 原理 ：利用兩組特殊的引物對差別表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。 3’ 端引物 ：利用 mRNA的 poly A尾巴設(shè)計。根據(jù) mRNA結(jié)構(gòu)分析知道， poly A尾巴之前的兩個堿基只有 12種可能的排列組合： 根據(jù)這 12種排列組合，設(shè)計 12種不同的引物，這樣就將所有 mRNA分成了 12組。這些引物由 11~12個 T及兩個其它的堿基組成，用通式 5’ T11MN或 5’ T12MN表示， M為 A、 G、 C的任一種， N為 A、 G、 C、 T的任一種。這種引物稱 錨定引物 。 5’ 端引物 ： 5’端為 10個堿基（ 10mer） 組成的隨機(jī)引物。每一個隨機(jī)引物都可能與總 mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點也可能在 mRNA的不同位點上。 用一種 3’錨定引物和一種 5’隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得 50~100條 100~500bp的 DNA擴(kuò)增帶。為了要尋找更多的 DNA差異帶，應(yīng)使用全部的 12種錨定引物以及盡可能多的 5’隨機(jī)引物。 ? 抑制性差減雜交 (SSH) Diatchenko L, et al. PNAS 1996。 93:60256030 ? Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissuespecific cDNA probes and libraries 抑制性差減雜交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) ? 原理 SSH是差減雜交與 PCR結(jié)合的快速分離差異基因的方法。運用雜交動力學(xué)原理，豐度高的單鏈 DNA退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈 DNA，使 不同豐度的單鏈 DNA得到均衡 ；抑制 PCR利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu) , 無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增，從而使 目的基因得到富集、分離。 ?方法 ? 提取 實驗組和對照組 mRNA合成雙鏈 cDNA， 經(jīng)識別 4 堿基的限制性內(nèi)切酶切割 ? 實驗組 cDNA平均分為 2份 ， 分別連接 2個接頭 ? 進(jìn)行 2輪差減雜交和抑制性 PCR ? 獲得富集的目的基因 抑制性 差減雜交 (SSH) 流程圖 檢測組 (Tester) — 含目的基因 cDNA，加接頭 驅(qū)逐組 (Driver) — 不含目的基因 cDNA，不加接頭 * 接頭 含 PCR 引物 正向 SSH: 易感者 (Tester) + 不易感者 (Driver) 易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因 反向 SSH: 不易感者 (Tester) + 易感者 (Driver) 不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因 抑制性差減雜交 (SSH) ? 優(yōu)點 采用兩次差減雜交和 PCR， 保證了高特異性 (假陽性率可降至 6％ )。 在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異表達(dá)基因 。操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法 ? 缺點 起始材料需要 ?g 級量 mRNA。 SSH差減克隆片段較小，獲取 cDNA全長序列有一定難度 抑制性差減雜交 (SSH) ? Elkeles A,et al. Mol Cell Biol 1999。 19: 25942600 ? The cfos protooncogene is a target for transactivation by the p53 tumor suppressor ? 采用 SSH法證實 , 在 p53介 導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中， cfos是 p53轉(zhuǎn)錄刺激的靶基因 ,從而提供了這兩種重要調(diào)控蛋白相互作用的直接依據(jù) 抑制性差減雜交 (SSH) ? Kostic C and Shaw PH. Oncogene 2022。 19:39783987 ? Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genes ? 通過 SSH比較了 p53缺失和含 p53的結(jié)腸癌細(xì)胞株間基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn) 16個 p53依賴的下游靶基因 抑制性差減雜交 (SSH) 基因表達(dá)系列分析 (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 是一種用于定量、高通量基因表達(dá)分析的實驗方法 (Velculescu et al., 1995)。 SAGE原理 : 分離每個轉(zhuǎn)錄本的特定位置的較短的單一的序列標(biāo)簽（約 914個堿基對），這些短的序列被連接、克隆和測序，特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對應(yīng)基因的表達(dá)豐度。 Serial analysis of gene expression (SAGE) 技術(shù)流程 反轉(zhuǎn)錄 酶切 連接 測序 單條測序＝＝對 30－ 40條 EST測序 分析 由于采樣量大大提高，可對低表達(dá)基因進(jìn)行分析： 基因表達(dá)量分析、尋找新基因等等 實驗步驟較長要求較高 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 指在生物基因組中帶有插入或整合入的外源基因，生物個體能將它一傳給后代，并表達(dá)出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。 Transgenic Animal ? Animal in which a segment of DNA has been physically inserted into the genome. ? The genome of all cells of the anism contains the DNA segment. ? The DNA segment is present in the germ line so it can be transmitted to progeny as a Mendelian trait. Retroviral Mediated Gene Transfer MoMuLV Producing Cells Mouse embryos Insertion of viral DNA containing transgene into embryos Transgenic Mouse X 1cell pronuclear stage mouse embryo. PMS + HCG to superovulate ? Pregnant Foster Mother Oviduct Transfer + + 2cell stage embryo Holding Pipette Injection Pipette 基因敲除（ Knock out） Step 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of