【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 事先測(cè)出 ? 步驟： ? 末端測(cè)定 ? 二硫鍵測(cè)定 ? 兩種裂解法制短肽 ? 純化短肽 ? 自動(dòng)蛋白測(cè)序儀分析 ? 肽段序列重迭法排序 ? 確定二硫鍵位置 牛胰島素的結(jié)構(gòu) 小 結(jié) ? 蛋白質(zhì)是由 20種氨基酸組成的。氨基酸性質(zhì)方面的差別反映了它們側(cè)鏈的不同。除了甘氨酸沒(méi)有手性碳以外，其他 19種氨基酸都至少含有一個(gè)手性碳。 ? 氨基酸的側(cè)鏈可以按照它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為：脂肪族的、芳香族的、含硫的、含醇的、堿性的、酸性的和酰胺類。 ? 氨基酸和多肽的酸性和堿性基團(tuán)的離子狀態(tài)取決于 pH。 ? 許多氨基酸具有非極性的側(cè)鏈，在水溶液中它們傾向于聚集在一起，以減少與水相互作用的面積，這種傾向稱為疏水相互作用。 ? 茚三酮與脯氨酸反應(yīng)生成黃色化合物，與其它氨基酸生成的都是紫色化合物。 2,4二硝基氟苯、丹黃酰氯和苯異硫氰酸酯都能與氨基反應(yīng)。 ? 蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基是通過(guò)肽鍵連接的，殘基的序列稱之為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。肽和小的蛋白質(zhì)可以利用液相或固相合成法合成。 ? 可以根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、凈電荷、大小以及結(jié)合特性上的差異，從生物資源中純化蛋白質(zhì)。常用方法包括離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、 HPLC、 SDSPAGE、等電聚焦和雙向電泳等方法。 ? 多肽的氨基酸序列可以通過(guò) Edman降解確定。利用蛋白酶和化學(xué)試劑有選擇地水解，結(jié)合 Edman降解可確定大的蛋白質(zhì)的序列。 ? 比較蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以揭示進(jìn)化關(guān)系，種屬的不同常反映在它們蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異上。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu) 學(xué)習(xí)目標(biāo) ◆ 掌握 a螺旋、 b折疊和膠原的結(jié)構(gòu)特征，二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)概念，維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的主要作用力。 ◆熟悉肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)構(gòu)特征以及它們的氧飽和曲線和鐮刀型細(xì)胞貧血病的起因。 ? 大多數(shù)蛋白質(zhì)可以分為兩種主要類型：纖維蛋白（ Fibrous proteins）和球蛋白（ globular proteins）。纖維蛋白的主要功能是維持和支撐單個(gè)的細(xì)胞和整個(gè)的有機(jī)體。 a角蛋白和膠原蛋白是最常見(jiàn)的纖維蛋白， a角蛋白是毛發(fā)和動(dòng)物尾巴的主要成分，而膠原蛋白是腱、皮膚、骨骼和牙齒的主要蛋白成分。 ? 大多數(shù)球蛋白是水溶性的、多肽鏈緊密折疊、輪廓上象一個(gè)球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一個(gè)疏水的內(nèi)部環(huán)境和一個(gè)親水的表面 . 概 念 ? 蛋白質(zhì)分子：蛋白質(zhì)中具有完整生物功能的最小結(jié)構(gòu)單位。有的包含一條多肽，有的包含多條多肽。 ? 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）：一條或數(shù)條多肽鏈上所有原子在三維空間中的排布。 ? 構(gòu)型的改變是由于共價(jià)鍵的變化產(chǎn)生的，構(gòu)想的改變是由于單鍵的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的。 一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次 ? 由于蛋白質(zhì)是個(gè)生物大分子，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，所以其結(jié)構(gòu)是通過(guò)四種水平描述的。其中包括蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（ primary structure）、二級(jí)結(jié)構(gòu)（ secondary structure）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（ tertiary structure）和四級(jí)結(jié)構(gòu)（ quaternary structure）。 ? X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法能測(cè)定晶體中蛋白分子構(gòu)象；二維核磁共振法能分析水中蛋白分子構(gòu)象。 ? 一級(jí)結(jié)構(gòu)就是共價(jià)連接的氨基酸殘基的序列，它描述的是蛋白質(zhì)的線性（或一維）結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是通過(guò)另外三種水平：二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)描述的。形成和維持（或稱之穩(wěn)定）這三種水平結(jié)構(gòu)的力主要是非共價(jià)鍵。 ? 二級(jí)結(jié)構(gòu)是通過(guò)肽鍵中的酰胺氮和羰基氧之間形成的氫鍵維持的，通常二級(jí)結(jié)構(gòu)指的是 a螺旋和b折疊。 ? 三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條多肽鏈形成緊密的一個(gè)或多個(gè)球狀單位或結(jié)構(gòu)域，三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定依賴于非相鄰的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用。 ? 四級(jí)結(jié)構(gòu)并不是每個(gè)蛋白質(zhì)都具有的，只有那些由兩條或兩條以上多肽鏈組成的蛋白質(zhì)才具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，每一條肽鏈也稱為亞基，肽鏈可以是相同的，也可以是不同的。 ? 一般來(lái)說(shuō)纖維蛋白的特性通過(guò)它的二級(jí)結(jié)構(gòu)就可表現(xiàn)出來(lái)，但球蛋白的生物學(xué)功能通常都是以三級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出來(lái)的，而某些球蛋白的生物學(xué)活性則需要四級(jí)結(jié)構(gòu)。 二、肽單位平面結(jié)構(gòu)和二面角 肽單位的特征 ? 肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì) ， 不能自由旋轉(zhuǎn)； ? 肽單位上的 6個(gè)原子都位于同一個(gè)剛性平面上 ， 稱為酰胺平面 ? 盡管繞肽鍵旋轉(zhuǎn)存在很大的障礙，但肽單位可以選擇兩種可能構(gòu)象中的一種：反式（ trans）構(gòu)象，或順式（ cis）構(gòu)象。 ? 由于連接在兩個(gè) a碳上的側(cè)鏈基團(tuán)之間的立體干擾，不利于順式構(gòu)象的形成，對(duì)伸展的反式構(gòu)象的形成有利，因此蛋白質(zhì)中 幾乎所有的肽單位都是反式構(gòu)象 。但也有 例外 ，一般都出現(xiàn)在 脯氨酸 的酰胺氮參與的肽鍵，只是順式構(gòu)象引起的立體干擾比反式構(gòu)象多些。通過(guò) X射線晶體分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中大約有 6％的脯氨酸殘基處于順式構(gòu)象． 二面角 ? Cα2原子位于相鄰二個(gè)肽平面的交線上， Cα2原子上的Cα2— N1和 Cα2— C2鍵都是單鍵。肽平面 1可以圍繞Cα2— N1單鍵旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)的角度用 Φ表示；肽平面 2也可以圍繞 Cα2— C2單鍵旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)的角度用 Ψ表示。由于 Φ和 Ψ這二個(gè)轉(zhuǎn)角決定了相鄰二個(gè)肽平面在空間上的相對(duì)位置，因此，習(xí)慣上將這二個(gè)轉(zhuǎn)角稱為 二面角(dihedral angle)。 二面角決定多肽鏈主鏈骨架的構(gòu)象。 Cα2 N1 C2 肽平面 1 肽平面 2 Φ Ψ 維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵 ? 非共價(jià)鍵維持 ? 氫鍵 ? 范德華引力 ? 疏水作用力 ? 離子鍵 ? 二硫鍵 ? 配位鍵 二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 定義：指多肽鏈主鏈在一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤旋或折疊形成的有規(guī)律構(gòu)象 ? 維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的力是氫鍵 。 二級(jí)結(jié)構(gòu)不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象 。 ? 主要類型 ? α螺旋 ? β折疊片 ? β轉(zhuǎn)角 （ 回折 ） ? 無(wú)規(guī)卷曲 α螺旋 (αhelix) ? 每一圈包含 3 . 6個(gè)殘基 ， 螺距， 殘基高度 ， 螺旋半徑 。 ? 每一個(gè) φ角等于 57176。 ， 每一個(gè) ψ角等于 47176。 。 ? 相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵 。 即一個(gè)肽單位的羰基氧原子與其前的第三個(gè)肽單位的氨基氫原子生成一個(gè)氫鍵 。 氫鍵的取向與螺軸幾乎平行 。 氫鍵封閉環(huán)本身包含13個(gè)原子 。 α螺旋構(gòu)象允許所有的肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成 。因此 ， α螺旋構(gòu)象是相當(dāng)穩(wěn)定的 ，是最普遍的螺旋形式 。 ? 與 α碳原子相連的 R側(cè)鏈，位于 α螺旋的外側(cè)。 β折疊 ? 二條 β折疊股平行排布，彼此以氫鍵相連，可以構(gòu)成 β折疊片。 ? 為了在相鄰主鏈骨架之間形成最多的氫鍵，避免相鄰側(cè)鏈間的空間障礙，各主鏈骨架同時(shí)作一定程度的折疊，從而產(chǎn)生一個(gè)折疊的片層。 ? 其側(cè)鏈近似垂直于相鄰二個(gè)平面的交線，交替地位于片層的兩側(cè)。 平行 式 反平行式 回折 ? 在多肽鏈中，經(jīng)常出現(xiàn)180176。 轉(zhuǎn)彎的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)就是回折 (reverse turn) 。 ? 通常有 β轉(zhuǎn)角和 γ轉(zhuǎn)角兩種形式。 β轉(zhuǎn)角與轉(zhuǎn)彎相關(guān)的有 4個(gè)氨基酸殘基，第一個(gè)氨基酸殘基的 C═O和第四個(gè)氨基酸殘基的 N— H之間形成氫鍵，稱為 4→1 氫鍵，氫鍵封閉 10個(gè)原子。另一種構(gòu)象是 γ轉(zhuǎn)角，第一個(gè)氨基酸殘基的 C═O和第三個(gè)氨基酸殘基的 N— H之間形成氫鍵，稱為 3→1 氫鍵。 無(wú)規(guī)卷曲 ? 沒(méi)有規(guī)律性的多肽鏈主鏈骨架的構(gòu)象，就是無(wú)規(guī)卷曲。 ? 球蛋白分子中，往往含有較多的無(wú)規(guī)卷曲。 ? 無(wú)規(guī)卷曲往往與生物活性有關(guān)。它對(duì)外界理化因子極為敏感。 超二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 在球狀蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)順序上 ， 相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在三維折疊中相互靠近 ， 彼此作用 ， 在局部區(qū)域形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的聚合體 ， 就是超二級(jí)結(jié)構(gòu) 。 ? 常見(jiàn)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)有 αα、 βββ、 βαβ等三種組合形式 ， 另外還有 βαβαβ、 βCβ結(jié)構(gòu) （ C代表無(wú)規(guī)卷曲 ） 也可見(jiàn)到 。在此基礎(chǔ)上 ， 多肽鏈可折疊成球狀的三級(jí)結(jié)構(gòu) 。 結(jié)構(gòu)域 ? 在較大的蛋白質(zhì)分子里 ， 多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上折疊成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的球狀區(qū)域 ，稱為 結(jié)構(gòu)域 。 ? 它是較大球蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊單位 。 S SS SS SSSVMHLCM1CL抗原結(jié)合部位補(bǔ)體結(jié)合部位VLCM2CM3分子的 12 個(gè)結(jié)構(gòu)域I g G三級(jí)結(jié)構(gòu) ? 指一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)（超二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的盤繞、折疊，從而產(chǎn)生特定的空間結(jié)構(gòu) ? 定義 ：廣義講，三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中所有原子的空間排布 ? 維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的力有疏水作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵（靜電引力）。另外二硫鍵在某些蛋白質(zhì)中也起著非常重要的作用。 四級(jí)結(jié)構(gòu) ? 定義：由相同或不同的亞基 (或分子 )按照一定的排布方式聚合而成的聚合體結(jié)構(gòu) ? 較大的球蛋白分子，往往由二條或更多條的多肽鏈組成功能單位。這些多肽鏈本身都具有球狀的三級(jí)結(jié)構(gòu)，彼此以 非共價(jià)鍵 相連。這些多肽鏈就是球蛋白分子的亞基 (亞單位 ) ? 由少數(shù)亞基聚合而成的蛋白質(zhì)，稱為寡聚蛋白 (Oligomer protein)；由幾十個(gè)，甚至于上千個(gè)亞基聚合而成的蛋白質(zhì)，稱為多聚蛋白 (polymer protein) ? 寡聚蛋白 特有的空間結(jié)構(gòu) ? 寡聚蛋白 —— ? 由數(shù)條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)通過(guò) 次級(jí)鍵 疊合而成 ? 亞基單獨(dú)沒(méi)有生物功能 亞基 血紅蛋白 四亞基兩兩相同，分別稱為 α1 、 α β β2； 第五節(jié) 多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一、多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? 催產(chǎn)素 (oxytocin)和加壓素 (vasopression)都是由人和高等動(dòng)物的垂體后葉所分泌的多肽激素。 ? 催產(chǎn)素能促進(jìn)子宮和乳腺平滑肌收縮，臨床上用于引產(chǎn)和減少產(chǎn)后