【文章內(nèi)容簡介】 事先測出 ? 步驟： ? 末端測定 ? 二硫鍵測定 ? 兩種裂解法制短肽 ? 純化短肽 ? 自動蛋白測序儀分析 ? 肽段序列重迭法排序 ? 確定二硫鍵位置 牛胰島素的結構 小 結 ? 蛋白質(zhì)是由 20種氨基酸組成的。氨基酸性質(zhì)方面的差別反映了它們側鏈的不同。除了甘氨酸沒有手性碳以外，其他 19種氨基酸都至少含有一個手性碳。 ? 氨基酸的側鏈可以按照它們的化學結構分為：脂肪族的、芳香族的、含硫的、含醇的、堿性的、酸性的和酰胺類。 ? 氨基酸和多肽的酸性和堿性基團的離子狀態(tài)取決于 pH。 ? 許多氨基酸具有非極性的側鏈，在水溶液中它們傾向于聚集在一起，以減少與水相互作用的面積，這種傾向稱為疏水相互作用。 ? 茚三酮與脯氨酸反應生成黃色化合物，與其它氨基酸生成的都是紫色化合物。 2,4二硝基氟苯、丹黃酰氯和苯異硫氰酸酯都能與氨基反應。 ? 蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基是通過肽鍵連接的，殘基的序列稱之為蛋白質(zhì)的一級結構。肽和小的蛋白質(zhì)可以利用液相或固相合成法合成。 ? 可以根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、凈電荷、大小以及結合特性上的差異，從生物資源中純化蛋白質(zhì)。常用方法包括離子交換層析、凝膠過濾層析、 HPLC、 SDSPAGE、等電聚焦和雙向電泳等方法。 ? 多肽的氨基酸序列可以通過 Edman降解確定。利用蛋白酶和化學試劑有選擇地水解，結合 Edman降解可確定大的蛋白質(zhì)的序列。 ? 比較蛋白質(zhì)的一級結構可以揭示進化關系，種屬的不同常反映在它們蛋白質(zhì)的一級結構的差異上。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的高級結構 學習目標 ◆ 掌握 a螺旋、 b折疊和膠原的結構特征，二級、三級和四級結構概念，維持蛋白質(zhì)空間結構的主要作用力。 ◆熟悉肌紅蛋白和血紅蛋白結構特征以及它們的氧飽和曲線和鐮刀型細胞貧血病的起因。 ? 大多數(shù)蛋白質(zhì)可以分為兩種主要類型：纖維蛋白（ Fibrous proteins）和球蛋白（ globular proteins）。纖維蛋白的主要功能是維持和支撐單個的細胞和整個的有機體。 a角蛋白和膠原蛋白是最常見的纖維蛋白， a角蛋白是毛發(fā)和動物尾巴的主要成分，而膠原蛋白是腱、皮膚、骨骼和牙齒的主要蛋白成分。 ? 大多數(shù)球蛋白是水溶性的、多肽鏈緊密折疊、輪廓上象一個球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一個疏水的內(nèi)部環(huán)境和一個親水的表面 . 概 念 ? 蛋白質(zhì)分子：蛋白質(zhì)中具有完整生物功能的最小結構單位。有的包含一條多肽，有的包含多條多肽。 ? 蛋白質(zhì)高級結構（構象）：一條或數(shù)條多肽鏈上所有原子在三維空間中的排布。 ? 構型的改變是由于共價鍵的變化產(chǎn)生的，構想的改變是由于單鍵的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的。 一、蛋白質(zhì)的結構層次 ? 由于蛋白質(zhì)是個生物大分子，結構比較復雜，所以其結構是通過四種水平描述的。其中包括蛋白質(zhì)的一級結構（ primary structure）、二級結構（ secondary structure）、三級結構（ tertiary structure）和四級結構（ quaternary structure）。 ? X射線晶體結構分析法能測定晶體中蛋白分子構象；二維核磁共振法能分析水中蛋白分子構象。 ? 一級結構就是共價連接的氨基酸殘基的序列，它描述的是蛋白質(zhì)的線性（或一維）結構。蛋白質(zhì)的三維結構是通過另外三種水平：二級結構、三級結構和四級結構描述的。形成和維持（或稱之穩(wěn)定）這三種水平結構的力主要是非共價鍵。 ? 二級結構是通過肽鍵中的酰胺氮和羰基氧之間形成的氫鍵維持的，通常二級結構指的是 a螺旋和b折疊。 ? 三級結構是指一條多肽鏈形成緊密的一個或多個球狀單位或結構域，三級結構的穩(wěn)定依賴于非相鄰的氨基酸殘基側鏈的相互作用。 ? 四級結構并不是每個蛋白質(zhì)都具有的，只有那些由兩條或兩條以上多肽鏈組成的蛋白質(zhì)才具有四級結構，每一條肽鏈也稱為亞基，肽鏈可以是相同的，也可以是不同的。 ? 一般來說纖維蛋白的特性通過它的二級結構就可表現(xiàn)出來，但球蛋白的生物學功能通常都是以三級結構表現(xiàn)出來的，而某些球蛋白的生物學活性則需要四級結構。 二、肽單位平面結構和二面角 肽單位的特征 ? 肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì) ， 不能自由旋轉(zhuǎn)； ? 肽單位上的 6個原子都位于同一個剛性平面上 ， 稱為酰胺平面 ? 盡管繞肽鍵旋轉(zhuǎn)存在很大的障礙，但肽單位可以選擇兩種可能構象中的一種：反式（ trans）構象，或順式（ cis）構象。 ? 由于連接在兩個 a碳上的側鏈基團之間的立體干擾，不利于順式構象的形成，對伸展的反式構象的形成有利，因此蛋白質(zhì)中 幾乎所有的肽單位都是反式構象 。但也有 例外 ，一般都出現(xiàn)在 脯氨酸 的酰胺氮參與的肽鍵，只是順式構象引起的立體干擾比反式構象多些。通過 X射線晶體分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中大約有 6％的脯氨酸殘基處于順式構象． 二面角 ? Cα2原子位于相鄰二個肽平面的交線上， Cα2原子上的Cα2— N1和 Cα2— C2鍵都是單鍵。肽平面 1可以圍繞Cα2— N1單鍵旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)的角度用 Φ表示；肽平面 2也可以圍繞 Cα2— C2單鍵旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)的角度用 Ψ表示。由于 Φ和 Ψ這二個轉(zhuǎn)角決定了相鄰二個肽平面在空間上的相對位置，因此，習慣上將這二個轉(zhuǎn)角稱為 二面角(dihedral angle)。 二面角決定多肽鏈主鏈骨架的構象。 Cα2 N1 C2 肽平面 1 肽平面 2 Φ Ψ 維持蛋白質(zhì)分子構象的化學鍵 ? 非共價鍵維持 ? 氫鍵 ? 范德華引力 ? 疏水作用力 ? 離子鍵 ? 二硫鍵 ? 配位鍵 二級結構 ? 定義：指多肽鏈主鏈在一級結構的基礎上進一步盤旋或折疊形成的有規(guī)律構象 ? 維系二級結構的力是氫鍵 。 二級結構不涉及氨基酸殘基的側鏈構象 。 ? 主要類型 ? α螺旋 ? β折疊片 ? β轉(zhuǎn)角 （ 回折 ） ? 無規(guī)卷曲 α螺旋 (αhelix) ? 每一圈包含 3 . 6個殘基 ， 螺距， 殘基高度 ， 螺旋半徑 。 ? 每一個 φ角等于 57176。 ， 每一個 ψ角等于 47176。 。 ? 相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵 。 即一個肽單位的羰基氧原子與其前的第三個肽單位的氨基氫原子生成一個氫鍵 。 氫鍵的取向與螺軸幾乎平行 。 氫鍵封閉環(huán)本身包含13個原子 。 α螺旋構象允許所有的肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成 。因此 ， α螺旋構象是相當穩(wěn)定的 ，是最普遍的螺旋形式 。 ? 與 α碳原子相連的 R側鏈，位于 α螺旋的外側。 β折疊 ? 二條 β折疊股平行排布，彼此以氫鍵相連，可以構成 β折疊片。 ? 為了在相鄰主鏈骨架之間形成最多的氫鍵，避免相鄰側鏈間的空間障礙，各主鏈骨架同時作一定程度的折疊，從而產(chǎn)生一個折疊的片層。 ? 其側鏈近似垂直于相鄰二個平面的交線，交替地位于片層的兩側。 平行 式 反平行式 回折 ? 在多肽鏈中，經(jīng)常出現(xiàn)180176。 轉(zhuǎn)彎的結構，此結構就是回折 (reverse turn) 。 ? 通常有 β轉(zhuǎn)角和 γ轉(zhuǎn)角兩種形式。 β轉(zhuǎn)角與轉(zhuǎn)彎相關的有 4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基的 C═O和第四個氨基酸殘基的 N— H之間形成氫鍵，稱為 4→1 氫鍵，氫鍵封閉 10個原子。另一種構象是 γ轉(zhuǎn)角，第一個氨基酸殘基的 C═O和第三個氨基酸殘基的 N— H之間形成氫鍵，稱為 3→1 氫鍵。 無規(guī)卷曲 ? 沒有規(guī)律性的多肽鏈主鏈骨架的構象，就是無規(guī)卷曲。 ? 球蛋白分子中，往往含有較多的無規(guī)卷曲。 ? 無規(guī)卷曲往往與生物活性有關。它對外界理化因子極為敏感。 超二級結構 ? 在球狀蛋白質(zhì)分子的一級結構順序上 ， 相鄰的二級結構常常在三維折疊中相互靠近 ， 彼此作用 ， 在局部區(qū)域形成規(guī)則的二級結構的聚合體 ， 就是超二級結構 。 ? 常見的超二級結構有 αα、 βββ、 βαβ等三種組合形式 ， 另外還有 βαβαβ、 βCβ結構 （ C代表無規(guī)卷曲 ） 也可見到 。在此基礎上 ， 多肽鏈可折疊成球狀的三級結構 。 結構域 ? 在較大的蛋白質(zhì)分子里 ， 多肽鏈在二級結構基礎上折疊成幾個相對獨立的球狀區(qū)域 ，稱為 結構域 。 ? 它是較大球蛋白分子三級結構的折疊單位 。 S SS SS SSSVMHLCM1CL抗原結合部位補體結合部位VLCM2CM3分子的 12 個結構域I g G三級結構 ? 指一條多肽鏈在二級結構（超二級結構及結構域）的基礎上，進一步的盤繞、折疊，從而產(chǎn)生特定的空間結構 ? 定義 ：廣義講，三級結構是指多肽鏈中所有原子的空間排布 ? 維系三級結構的力有疏水作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵（靜電引力）。另外二硫鍵在某些蛋白質(zhì)中也起著非常重要的作用。 四級結構 ? 定義：由相同或不同的亞基 (或分子 )按照一定的排布方式聚合而成的聚合體結構 ? 較大的球蛋白分子，往往由二條或更多條的多肽鏈組成功能單位。這些多肽鏈本身都具有球狀的三級結構，彼此以 非共價鍵 相連。這些多肽鏈就是球蛋白分子的亞基 (亞單位 ) ? 由少數(shù)亞基聚合而成的蛋白質(zhì)，稱為寡聚蛋白 (Oligomer protein)；由幾十個，甚至于上千個亞基聚合而成的蛋白質(zhì)，稱為多聚蛋白 (polymer protein) ? 寡聚蛋白 特有的空間結構 ? 寡聚蛋白 —— ? 由數(shù)條具有三級結構的蛋白質(zhì)通過 次級鍵 疊合而成 ? 亞基單獨沒有生物功能 亞基 血紅蛋白 四亞基兩兩相同，分別稱為 α1 、 α β β2； 第五節(jié) 多肽、蛋白質(zhì)結構與功能的關系 一、多肽結構與功能的關系 ? 催產(chǎn)素 (oxytocin)和加壓素 (vasopression)都是由人和高等動物的垂體后葉所分泌的多肽激素。 ? 催產(chǎn)素能促進子宮和乳腺平滑肌收縮，臨床上用于引產(chǎn)和減少產(chǎn)后