【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 苷酸的切除修復(fù)中起到作用 Ki67 proliferation related antigen KiS1 proliferation related antigen Phosphohistone Cyclin D1, E, A, B1 BrdUrd Incorporation –Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一個(gè)胸腺核苷的類似物 –能夠在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期狀態(tài)分析中起作用 –BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)的細(xì)胞相結(jié)合 –使用 BrdU抗體能夠檢測(cè)到 BrdU BrdUrd Incorporation 細(xì)胞分裂的分析 —哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)需要有大量的增殖，能夠確?？乖禺愋缘?T細(xì)胞和 B細(xì)胞具有足夠的增殖速度，能夠?qū)Ω吨尾∩镌斐傻母腥? —CFSE是一種示蹤染料，能夠均等地在兩個(gè)子代細(xì)胞中分布，其結(jié)果可以區(qū)分出 810代的子細(xì)胞。 Tracing Dye(CFSE) Apoptotic Cell Death a geically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis Flow cytometry of apoptotic cell death —細(xì)胞散射光 – 在細(xì)胞調(diào)亡中，細(xì)胞收縮，從而 FSC下降，SSC上升或是沒(méi)有明顯變化 Flow cytometry of apoptotic cell death —熒光吸收 – 細(xì)胞的胞膜對(duì)于 DNA染料的通透性和細(xì)胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像 PI、 EB、 Hoechst33342等，可以用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞 Flow cytometry of apoptotic cell death —FCM of Caspases – 通過(guò)抗體和活化的 caspase3片斷相結(jié)合來(lái)檢測(cè) – 使用特異性的 caspase3熒光底物 – 新的抗原決定基 CK18 Flow cytometry of apoptotic cell death —線粒體功能的變化 – TMP會(huì)在調(diào)亡中產(chǎn)生，可以通過(guò)一些標(biāo)記用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用有膜穿透性的親脂性陽(yáng)離子熒光染料，如 Rh123, DiOC6, JC1,CMXRos等，可作為流式檢測(cè)的探針。 – 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，一個(gè)線粒體膜表面蛋白 ——7A6抗原會(huì)出現(xiàn) – Bcl2/bax family of proteins. Flow cytometry of apoptotic cell death —鈣離子流和 pH值變化 – 胞漿內(nèi) Ca2+ 水平的上升和由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化造成的選擇性的 pH值的調(diào)節(jié)降低是伴隨著細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的后果之一。 – 使用 Ca2+ 選擇性熒光探針，如 Quin2, Fluo3, Indo1 通過(guò)流式檢測(cè)是測(cè)定細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的最佳方案 – 酸化的檢測(cè)同樣可以用對(duì) pH敏感的熒光探針，如 DCH, BCECF, BCECFAM, SNAFLs, SNARFs等進(jìn)行檢測(cè) Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution Flow cytometry of apoptotic cell death —DNA 鏈的斷裂 – 細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些 Caspase的底物）在核小體之間剪切核 DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180200 bp 的 DNA片段。 斷裂的末端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶 (TdT)連接上 dUTP。 Flow cytometry of apoptotic cell death —細(xì)胞 DNA含量 – 在凋亡細(xì)胞中，用 PI染色，通過(guò)流式檢測(cè) DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分 DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi) DNA含量下降造成的。 Flow Cytometry of Apoptotic Cells PI Fluorescence Events Apoptotic cells Normal G0/G1 cells An Integrated Approach to Cell Immunology Immune Function assay – 免疫細(xì)胞亞群檢測(cè) – Antigenpeptide specific T cells 檢測(cè) – Tcells 活化 – Treg Cells – 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 /趨化因子檢測(cè) – 磷酸化 淋巴細(xì)胞亞群分析 — 根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為 – B淋巴細(xì)胞（ CD19+）， 與體液免疫有關(guān) – T淋巴細(xì)胞（ CD3+）， 與細(xì)胞免疫有關(guān) ? 總 T和總 B可以用來(lái)判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 – NK細(xì)胞（ CD3CD16+56+）， 行使免疫監(jiān)控功能 ， 能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。 淋巴細(xì)胞亞群分析 – 根據(jù) CD CD8表達(dá)， T淋巴細(xì)胞又分為 – T輔助 /誘導(dǎo)細(xì)胞（ CD3+CD4+） – T抑制 /細(xì)胞毒性細(xì)胞（ CD3+CD8+） – Th/Ts 評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來(lái)監(jiān)測(cè)骨髓移植病人以免受到急性 GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血 Absolute Counts Cells per mL Positive Cell Absolute Count Beads Negative Cell CD4 PE CD4 PE 抗原特異性 T細(xì)胞 — 提供檢測(cè)者一個(gè)強(qiáng)有力的工具用于研究對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答和疫苗的開發(fā) MHC: Class I and Class II Gene Products —T cell受體不直接和可溶性抗原相連 ? 抗原必須通過(guò) MHC由抗原呈遞細(xì)胞傳遞給 T細(xì)胞 (Macrophages, Dendritic cells, B cells) —MHC Class I Gene Products ? 呈遞抗原給 CD8+ T cells ? 誘導(dǎo)細(xì)胞毒應(yīng)答 —MHC Class II Gene Products ? 呈遞抗原給 CD4+ T cells ? 誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，免疫球蛋白的分泌 MHC/TCR Signaling 二聚體可溶性 MHC類似物與四聚體的比較 Quantitation of antigenspecific T lymphocytes in peripheral blood HAM Control HIV CD8 TaxA2/Ig GagA2/Ig Treg細(xì)胞的檢測(cè) —Treg細(xì)胞與自身免疫耐受相關(guān)，通常的檢測(cè)方法用 CD4陽(yáng)性細(xì)胞中 CD25高表達(dá)，同時(shí)結(jié)合胞內(nèi) FoxP3含量來(lái)判斷 —最新發(fā)現(xiàn)人的 Treg細(xì)胞低表達(dá) CD127。CD127的表達(dá)模式與 Foxp3很接近，說(shuō)明低表達(dá) CD127，高 /中表達(dá) CD25的 CD4陽(yáng)性的 T淋巴細(xì)胞就是 Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞）。該方法比胞內(nèi)檢測(cè) Foxp3的優(yōu)點(diǎn)在于，檢測(cè)后的細(xì)胞可用于后續(xù)的培養(yǎng)及其他的體外試驗(yàn)。另外的優(yōu)點(diǎn)是用這種檢測(cè)方案分選的 Treg細(xì)胞得率更高。 Immu