【文章內(nèi)容簡介】 苷酸的切除修復(fù)中起到作用 Ki67 proliferation related antigen KiS1 proliferation related antigen Phosphohistone Cyclin D1, E, A, B1 BrdUrd Incorporation –Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一個胸腺核苷的類似物 –能夠在細胞增殖和細胞周期狀態(tài)分析中起作用 –BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)的細胞相結(jié)合 –使用 BrdU抗體能夠檢測到 BrdU BrdUrd Incorporation 細胞分裂的分析 —哺乳動物的免疫系統(tǒng)需要有大量的增殖，能夠確保抗原特異性的 T細胞和 B細胞具有足夠的增殖速度，能夠?qū)Ω吨尾∩镌斐傻母腥? —CFSE是一種示蹤染料，能夠均等地在兩個子代細胞中分布，其結(jié)果可以區(qū)分出 810代的子細胞。 Tracing Dye(CFSE) Apoptotic Cell Death a geically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis Flow cytometry of apoptotic cell death —細胞散射光 – 在細胞調(diào)亡中，細胞收縮，從而 FSC下降，SSC上升或是沒有明顯變化 Flow cytometry of apoptotic cell death —熒光吸收 – 細胞的胞膜對于 DNA染料的通透性和細胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像 PI、 EB、 Hoechst33342等，可以用來區(qū)分活細胞、死細胞和凋亡細胞 Flow cytometry of apoptotic cell death —FCM of Caspases – 通過抗體和活化的 caspase3片斷相結(jié)合來檢測 – 使用特異性的 caspase3熒光底物 – 新的抗原決定基 CK18 Flow cytometry of apoptotic cell death —線粒體功能的變化 – TMP會在調(diào)亡中產(chǎn)生，可以通過一些標記用流式細胞儀檢測。使用有膜穿透性的親脂性陽離子熒光染料，如 Rh123, DiOC6, JC1,CMXRos等，可作為流式檢測的探針。 – 當細胞發(fā)生調(diào)亡時，一個線粒體膜表面蛋白 ——7A6抗原會出現(xiàn) – Bcl2/bax family of proteins. Flow cytometry of apoptotic cell death —鈣離子流和 pH值變化 – 胞漿內(nèi) Ca2+ 水平的上升和由于細胞內(nèi)環(huán)境酸化造成的選擇性的 pH值的調(diào)節(jié)降低是伴隨著細胞凋亡產(chǎn)生的后果之一。 – 使用 Ca2+ 選擇性熒光探針，如 Quin2, Fluo3, Indo1 通過流式檢測是測定細胞內(nèi) Ca2+濃度的最佳方案 – 酸化的檢測同樣可以用對 pH敏感的熒光探針，如 DCH, BCECF, BCECFAM, SNAFLs, SNARFs等進行檢測 Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution Flow cytometry of apoptotic cell death —DNA 鏈的斷裂 – 細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些 Caspase的底物）在核小體之間剪切核 DNA，產(chǎn)生大量長度在180200 bp 的 DNA片段。 斷裂的末端可以通過末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶 (TdT)連接上 dUTP。 Flow cytometry of apoptotic cell death —細胞 DNA含量 – 在凋亡細胞中，用 PI染色，通過流式檢測 DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細胞，其染色熒光強度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分 DNA泄漏出去，造成細胞內(nèi) DNA含量下降造成的。 Flow Cytometry of Apoptotic Cells PI Fluorescence Events Apoptotic cells Normal G0/G1 cells An Integrated Approach to Cell Immunology Immune Function assay – 免疫細胞亞群檢測 – Antigenpeptide specific T cells 檢測 – Tcells 活化 – Treg Cells – 細胞內(nèi)細胞因子 /趨化因子檢測 – 磷酸化 淋巴細胞亞群分析 — 根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為 – B淋巴細胞（ CD19+）， 與體液免疫有關(guān) – T淋巴細胞（ CD3+）， 與細胞免疫有關(guān) ? 總 T和總 B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 – NK細胞（ CD3CD16+56+）， 行使免疫監(jiān)控功能 ， 能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用。 淋巴細胞亞群分析 – 根據(jù) CD CD8表達， T淋巴細胞又分為 – T輔助 /誘導(dǎo)細胞（ CD3+CD4+） – T抑制 /細胞毒性細胞（ CD3+CD8+） – Th/Ts 評價那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性 GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾?。愶L濕性關(guān)節(jié)炎、 SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血 Absolute Counts Cells per mL Positive Cell Absolute Count Beads Negative Cell CD4 PE CD4 PE 抗原特異性 T細胞 — 提供檢測者一個強有力的工具用于研究對病毒抗原的免疫應(yīng)答和疫苗的開發(fā) MHC: Class I and Class II Gene Products —T cell受體不直接和可溶性抗原相連 ? 抗原必須通過 MHC由抗原呈遞細胞傳遞給 T細胞 (Macrophages, Dendritic cells, B cells) —MHC Class I Gene Products ? 呈遞抗原給 CD8+ T cells ? 誘導(dǎo)細胞毒應(yīng)答 —MHC Class II Gene Products ? 呈遞抗原給 CD4+ T cells ? 誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，免疫球蛋白的分泌 MHC/TCR Signaling 二聚體可溶性 MHC類似物與四聚體的比較 Quantitation of antigenspecific T lymphocytes in peripheral blood HAM Control HIV CD8 TaxA2/Ig GagA2/Ig Treg細胞的檢測 —Treg細胞與自身免疫耐受相關(guān)，通常的檢測方法用 CD4陽性細胞中 CD25高表達，同時結(jié)合胞內(nèi) FoxP3含量來判斷 —最新發(fā)現(xiàn)人的 Treg細胞低表達 CD127。CD127的表達模式與 Foxp3很接近，說明低表達 CD127，高 /中表達 CD25的 CD4陽性的 T淋巴細胞就是 Treg細胞（調(diào)節(jié)性 T細胞）。該方法比胞內(nèi)檢測 Foxp3的優(yōu)點在于，檢測后的細胞可用于后續(xù)的培養(yǎng)及其他的體外試驗。另外的優(yōu)點是用這種檢測方案分選的 Treg細胞得率更高。 Immu