蘭大分子ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-02 06:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 要輔以堿水解測定 Trp的含量。 水解中氨基酸的破壞程度與保溫時(shí)間呈線性關(guān)系。 蛋白質(zhì)的氨基酸組成一般用每摩爾蛋白質(zhì)中含氨基酸殘基的摩爾數(shù)表示，或用每 100 g蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)表示。 多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化 目前 最常用也最有效的方法是 Edman化學(xué)裂解法 ，但只能降解較短的肽段。必須裂解長肽為短肽。 選用專一性強(qiáng)的水解酶類或化學(xué)試劑。要求是：裂解點(diǎn)少、專一性強(qiáng)、反應(yīng)產(chǎn)率高。 一、酶裂解法：用蛋白酶（ protease） 水解 ,常用的蛋白水解酶有 — 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。這些酶不同于氨肽酶和羧肽酶，都是肽鏈內(nèi)切酶，叫內(nèi)肽酶（ endopeptidase）。 1. 胰蛋白酶（ trypsin） 最常用的蛋白水解酶，專一性強(qiáng)， 斷裂 Lys或 Arg殘基羧基參與形成的肽鍵 。產(chǎn)生的肽段數(shù)目等與 Arg和 Lys總數(shù)加 1。 C O O HNH( C H2)3H2N RO+ OOOC O O HNH( H2C )3RONOOO O CN+H3( C H2)3HNN H2N+H2+OOO O CN+H3( C H2)3HNHNN+HO HO HO O CH3+N S H+H NO O CH3+N SN+H3H+2. 糜蛋白酶（ chymotrypsin）， 斷裂 Phe、 Trp和Tyr芳香氨基酸殘基的羧基端肽鍵 。 3. 嗜熱菌蛋白酶（ thermolysin）： 專一性差，用于斷裂較短的多肽或大肽鏈。 4. 胃蛋白酶（ pepsin） 要求斷裂的肽鍵兩側(cè)都是疏水性氨基酸，如 PhePhe等。 在二硫鍵的測定中也是主要的水解酶 。 5. 木瓜蛋白酶（ papain） 6. 葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶，高專一性肽鏈內(nèi)切酶。 葡萄球菌蛋白酶，又叫 Glu蛋白酶， 磷酸緩沖液，Glu和 Asp羧基端斷裂肽鍵 ； 碳酸氫銨或醋酸銨緩沖液，斷裂 Glu羧端肽鍵 。 梭菌蛋白酶， Arg羧端肽鍵 。 二、化學(xué)裂解法， 獲得的肽段比較大，適合在自動(dòng)測序儀中測定順序。 1. CNBr（ cyanogen bromide）法 , 只斷裂Met的羧基端的肽鍵。 2. 用羥胺法斷裂肽鍵， NH2OH 在 pH ，專一性斷裂 AsnGly肽鍵， AsnLeu和 AsnAla也能部分?jǐn)嗔?。得到大肽段。 3. 肽的分離純化。當(dāng)前 HPLC法有更好的應(yīng)用。 氨基酸序列測定 主要有 Edaman降解法，還有酶降解法、質(zhì)譜法、氣質(zhì)聯(lián)用（ GCMS）、 液質(zhì)聯(lián)用（ LCMS） 法等。 1. Edaman降解法， PITC法。在分析時(shí)常把肽鏈通過羧基固載，方便反應(yīng)進(jìn)行和檢測。 改進(jìn)的方法有： DNS－ Edman測序法，因?yàn)?DNS法靈敏度高，而 Edman法能提供逐次減少一個(gè)氨基酸的肽鏈；采用高靈敏度檢測試劑等。 N C S H 2 NC O O HR+H NH NRSOO HNN HOSRP T C a m i n o a c i dP T H a m i n o a c i dw e a k b a s eH+ 2. 酶降解法， 主要用外肽酶，如氨肽酶和羧肽酶 ，局限性大，只能用來測定末端附近幾個(gè)氨基酸。 3. 質(zhì)譜法（ mass spectrometry, MS） 主要采用軟電離技術(shù)，用電噴霧電離（ electrospray ionization, ESI）。 現(xiàn)在更加流行的是 ESITOFMS以及（ high resolution mass spectrometry, HRMS） 用的是 TOFTOF技術(shù)。 TOF是飛行時(shí)間（ time of flight, TOF） 技術(shù)的縮寫。 除去串聯(lián)質(zhì)譜外，氣質(zhì)聯(lián)用在氨基酸組分分析中也有不少成功的報(bào)道；但現(xiàn)在更加流行的趨勢是使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，稱為 LCMS或 HPLCMS。 4. 根據(jù)核苷酸序列的推定法。這是分子生物學(xué)的重要研究內(nèi)容。 Mass spectrometer measures the ratio of the mass to the electric charge of a particle ESI: a method of ionization or charging the macromolecule The mass of a particle can be calculated from the peaks of the spectrum Tandem MS (MS/MS) can give sequence information
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