超薄切片技術(shù)ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-05-31 13:17 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 rate) 1. 定義： 用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織和細(xì)胞中的 游離態(tài)水分的過(guò)程。 2. 脫水的原因： ⑴包埋時(shí)一般使用非水溶性包埋劑，為了更好的包埋樣 品，提高包埋質(zhì)量必須對(duì)樣品脫水； ⑵濕樣品反差低、必須干 燥； ⑶含水樣品在高真空下容易被破壞。 3. 脫水的原則： 逐級(jí)梯度脫水 (80%及以前 4℃ ) 30％ → 50％ → 70％ → 80％ → 90％ → 95％ (每次 5 ~15min)→100 ％ (2~3次，每次 15min)→100 ％環(huán) 氧丙烷 (乙醇脫水時(shí)必須的一步驟 ,15min) 生物電子顯微技術(shù) 4. 常用的脫水劑： 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、 環(huán)氧丙烷、包埋劑的單體。 5. 脫水注意事項(xiàng) : ⑴ 脫水要徹底 ⑵ 更換液體動(dòng)作要迅速 ⑶ 脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng) ⑷ 固定后的 樣品要充分漂洗 生物電子顯微技術(shù) 附加步驟： 塊染 （ Block Staining) 塊染 ：在脫水前或脫水時(shí)對(duì)組織塊進(jìn)行的染色叫塊染。 （在切成片之后的染色可稱為“片染”） 脫水前染色 ： 雙固定 → 漂洗 → ％ ~4%的醋酸雙氧鈾染色， 1h,4℃ → 脫水 脫水時(shí)染色 ： 脫水至 70％乙醇 → 硝酸鉛的 70％乙醇飽和溶液中 2h,4℃ → 70 ％乙醇漂洗 → 繼續(xù)脫水 生物電子顯微技術(shù) 四 滲透與包埋 目的 ：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部 ,以便與 細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合，以保證切出優(yōu)質(zhì) 的超薄切片。 步驟 ：滲透，包埋，聚合 （一）、滲透（ Infiltrate) 滲透： 用另一種溶液或混合液逐漸取代組織內(nèi)的脫 水劑（或前介質(zhì)），使細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙 被滲透液填充。 脫水劑的比例 ↘ 包埋劑 ↗→ 純包埋劑 脫水劑 :包埋劑＝ 3:1 → 1:1 → 1:3 → 純包埋劑 生物電子顯微技術(shù) 滲透時(shí)間表 (小時(shí)） 脫水劑：包埋劑 動(dòng)物材料 植物材料 體外培養(yǎng)細(xì)胞 3： 1 1 1 1： 1 1～ 4 1～ 12 ~1 1： 3 1～ 2 2～ 12 包埋： 將滲透好的樣品塊放入到適當(dāng)?shù)陌衲＞咧?，灌裝上純包埋劑包埋，經(jīng)加溫聚合形成一種固體基質(zhì)，牢固地支撐整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織，同時(shí)又不混亂其空間聯(lián)系，制成適于機(jī)械切割的固體包埋塊。 （二）、包埋 (embedding) 生物電子顯微技術(shù) 包埋劑應(yīng)具備的條件 : ⑴ 聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)節(jié) ⑵ 粘度低 ,易滲透 ⑶ 溶于脫水劑 ⑷ 電子透明度好 ,并具有一定的反差 ⑸ 聚合要充分、均勻，聚合溫度要盡可能低 ⑹ 本身無(wú)結(jié)構(gòu) ⑺ 熱穩(wěn)定性好 ,可耐電子束轟擊 ⑻ 來(lái)源豐富，且各批號(hào)性能盡可能一致 ⑼ 切片易染色 ,且對(duì)人體無(wú)害 生物電子顯微技術(shù) 常用包埋劑 1) 甲基丙烯酸酯 優(yōu)點(diǎn) ：分子量小，粘度低 ,易滲透； ,硬度易 調(diào)節(jié)，切割性能好；電子透明度高，電子反差 好；無(wú)毒性，便宜 缺點(diǎn) ：聚合需要一定條件；聚合后體積變 化大，聚合損傷大；不穩(wěn)定，不耐電子束轟擊 易升華或蒸發(fā) 2) 聚酯樹脂 優(yōu)點(diǎn) ：對(duì)樣品損傷小，耐電子束的轟擊，聚 合收縮小，適合于細(xì)菌和植物組織等硬樣品， 缺點(diǎn) ：不穩(wěn)定，易脆裂 生物電子顯微技術(shù) 3）水溶性包埋劑 常用試劑 ： 乙二醇甲基丙烯酸酯（ GMA） ，聚乙二醇 (PEG),甲基丙烯酸羥酸酯（ HPMA) 注意 ： GMA需低溫包埋，聚合時(shí) GMA和 HPMA需 紫外照射 應(yīng)用 ：適于電鏡細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)研究 4) 環(huán)氧樹脂類包埋劑： 特點(diǎn) ：聚合收縮率低，均勻，對(duì)樣品損傷小，耐轟 擊，但切片困難，染色后反差小，有刺激作用 常用試劑 ： Epon812 ,國(guó)產(chǎn) 618， ERL－ 4206 Epon812： 甘油多聚酯，低粘度，易滲透 加速劑： DMP30（ 2， 4， 6－ 三（二甲基氨 基甲基苯酚） 固化劑： DDSA（ 十二烷基琥珀酸酐），塊軟 MNA（ 六甲酸酐） ，塊硬 生物電子顯微技術(shù) 3. 常用配方： ⑴ Epon812配方 （ 1961， Luft) A液： Epon－ 812 5ml DDSA 8ml B液： Epon－ 812 5ml MNA 7ml 最終： A液 13， B液 15， DMP30 16滴（ 1~2%） 夏天： A： B=2： 8（ A多軟） 冬天： A： B=1： 9（ B多硬） 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) （ 2） 國(guó)產(chǎn) 618配方 : 618 1
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