超薄切片技術(shù)ppt課件(2)(已修改)
2025-05-16 13:17 本頁面
【正文】 生物電子顯微技術(shù) 第四章 超薄切片技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 一、生物樣品制備技術(shù)的重要性 二、 TEM樣品制備技術(shù)分類 四、超薄切片技術(shù)概述 第一節(jié) 基本概念 三、掃描電鏡樣品制備技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 一、生物樣品制備技術(shù)的重要性 1）電鏡本身的分辨本領(lǐng) 2）樣品的結(jié)構(gòu)和反差，而樣品的結(jié)構(gòu)與反差在很 大程度又取決于樣品制備技術(shù) 決定電鏡圖像分辨率的兩個(gè)因素 電鏡樣品應(yīng)具備的基本條件 1）樣品必須徹底干燥； 2）樣品要進(jìn)行提高反差處理 3）樣品厚度要適宜 4）樣品耐受電子束的轟擊 5）充分保存好生物樣品的超微結(jié)構(gòu) 生物電子顯微技術(shù) 二、 TEM樣品制備技術(shù)分類 超薄切片技術(shù)（普通） 冷凍超薄切片技術(shù) 冷凍置換和低溫包埋技術(shù) 金屬投影技術(shù) 表面復(fù)型技術(shù) 冷凍 (斷裂 )蝕刻及復(fù)型技術(shù) 免疫電鏡技術(shù) 電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù) TEM， SEM共有 電鏡放射自顯影技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 表面鍍金（噴鍍）技術(shù) 組織導(dǎo)電技術(shù) 冷凍斷裂技術(shù) 離子蝕刻技術(shù) 臨界點(diǎn)干燥技術(shù) 冷凍干燥技術(shù) 鑄型觀察技術(shù)（復(fù)型） 注： 最基本、最經(jīng)典的還是超薄切片技術(shù) SEM,TEM共有 三、掃描電鏡樣品制備技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 四、超薄切片技術(shù)概述 超薄切片 ★ 樣品厚度在 10～ 100nm之間的切片為～ 石蠟切片 h=10?m(5~50?m) 超薄切片 TEM專用，一般 500～ 700197。 制作超薄切片的必要性 1). 增加電子透射能力 2). 電鏡的場(chǎng)深大，切片太厚，上下結(jié)構(gòu)重 疊 ,使得圖像不清楚 3). 減少色差 4). 減少樣品對(duì)電子的吸收 生物電子顯微技術(shù) ⑴ 細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒有明顯的物質(zhì)凝聚、丟失、添加等人工效應(yīng) ⑵ 切片厚度 500～ 700197。為宜 ,小于 1000 197。 太薄： ?高，反差低 太厚： ?低，反差好，結(jié)構(gòu)重疊，電子甚至 不 能穿透 ⑶ 切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形，升華 ⑷ 切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差 ⑸ 切片均勻，無皺褶、刀痕，無染色劑或其他 化學(xué)物質(zhì)的沉淀 對(duì)超薄切片的要求 生物電子顯微技術(shù) 取材 → 固定 → 脫水 → 滲透 → 包埋 → 聚合 → 修塊 →切片 → 染色 超薄切片制備的一般程序： 生物電子顯微技術(shù) 第二節(jié) 普通超薄切片技術(shù) 一 取材 二 固定 三 脫水 四 滲透與包埋 五 超薄切片 六 電子染色 生物電子顯微技術(shù) 操作規(guī)則 :快 ,小 , 冷 ,準(zhǔn) ,穩(wěn) ,輕 (防損傷 ) ⑴ 快：動(dòng)作迅速 ,快取 ,投入固定液 ⑵ 小：樣品體積小 ,動(dòng) 1mm3,植寬 1，長(zhǎng) 3～ 4 ⑶ 冷： 0～ 4℃ ⑷ 準(zhǔn)：取的部位準(zhǔn)，有代表性、目的性 ⑸ 輕：操作輕巧，避免拉、鋸、壓 一、取材 含義 指從生物體上取下要觀察的組織塊。 取材操作規(guī)則 注意：由于水解酶的作用可引起細(xì)胞自溶 生物電子顯微技術(shù) ⑴動(dòng)物材料 麻醉 → 解剖 → 戊二醛預(yù)固定（ 0～ 4℃ ， 2％～ 5％） 在預(yù)冷的玻板上細(xì)切（ 1mm3） → 戊二醛前固定 (1～ 3h) → 漂洗（ 10～ 30min） → 1％ 鋨酸后固定 (1～ 2h) ⑵植物材料 葉片寬 1，長(zhǎng) 3～ 4，有時(shí)需脫蠟 根莖果實(shí) 1mm3 ⑶單細(xì)胞： 洗去有機(jī)成分 → 固定 → 預(yù)包埋 → 切塊 取材方法 A、按樣品類別分為： B、按取材地點(diǎn)分為： ⑴野外取材：冰壺 ⑵實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)取材 生物電子顯微技術(shù) 概念 ：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織殺死 ,同時(shí)把從細(xì)胞間的聯(lián)系到細(xì)胞器的分子結(jié)構(gòu)等全部組織的活體形態(tài)、精細(xì)結(jié)構(gòu)及其組成真實(shí)的保存下來 . 常用的固定方法 ? 化學(xué)方法：鋨酸（ OsO4), 戊二醛 （ C5H8O2), 甲醛 (HCHO)，高錳酸鉀 KMnO 重鉻酸鉀、丙烯醛 ? 物理方法：冷凍，干燥，高溫 二、固定 （一）固定的基本知識(shí) 生物電子顯微技術(shù) ⑴ 把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過 程立即停止 ,細(xì)胞和它周圍組織中的半液 體內(nèi)含物立即凝固而不分解 ,接近細(xì)胞有 機(jī)體的生活狀態(tài) ⑵ 防止以后的制備過程中丟失或添加成分 ⑶ 使其在電鏡下有良好的電子反差 固定的目的 生物電子顯微技術(shù) 固定的標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)線條清晰連續(xù)不斷，細(xì)胞基質(zhì)無明顯溶泡和顆粒凝集 生物電子顯微技術(shù) 1）組成： 固定液：固定劑＋緩沖液 2）作用： ⑴ 破壞細(xì)胞的酶活性系統(tǒng) ⑵ 穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，并保存之 ⑶ 接近細(xì)胞生活狀態(tài)的滲透壓 ,使細(xì)胞不收縮或膨脹 ⑷ 在組分的分子之間建立交聯(lián)，提供骨架穩(wěn)定細(xì)胞器的空間構(gòu)型 ⑸ 提供一定的電子反差 固定液的作用 生物電子顯微技術(shù) 1） 滲透力
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