超薄切片技術(shù)ppt課件(2)-資料下載頁(yè)
2025-05-04 13:17本頁(yè)面
【正文】 ） 先修頂面暴露樣品 后修四個(gè)側(cè)面 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) （五）、切片 超薄切片機(jī) (Ultramicrotome) ⑴ 按進(jìn)刀原理分為： 機(jī)械推進(jìn)式： AO型 熱膨脹式： I↗ 膨脹 ↗ 切片厚 ↗ LKB(Ⅲ ， Ⅳ ， Ⅴ ）， CQR－ 1 冷縮式 ⑵ LKB切片機(jī)構(gòu)造 ⑶ 切片的原理 加熱線圈 → 金屬臂膨脹 → 推進(jìn)樣品 → 電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)樣品臂上下運(yùn)動(dòng) → 切削 切片操作步驟： 裝塊 → 裝刀 → 對(duì)刀 → 加水 → 切片 → 撈片 生物電子顯微技術(shù) 返回 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 切片原則： 1）刀角、前角，切速參數(shù)的選擇原則： ⑴ 軟硬適中的包埋塊， 45刀角， 3~5前角， 2~5mm/s ⑵ 包埋塊硬 ,小刀角 ,切速??； 包埋塊軟 ,大刀角 ,切速大 ⑶ 較薄樣品 ,切速大 20mm/s 要獲得較大面積的切片，切速 1mm/s 生物電子顯微技術(shù) 2) 預(yù)先制作半薄切片的原則 : ⑴ 半薄切片的定義 ： 切片的厚度介于普通切片和超薄切片 之間的切片 ,~2181。m ⑵ 半薄切片的作用： 精確定位樣品特征位置點(diǎn)， 并篩選包埋塊 生物電子顯微技術(shù) 返回 生物電子顯微技術(shù) 切片厚度的判斷 顏色 厚度 (197。) 切片 厚度 分辨 率 反差 暗灰色 400197。 太薄 高 小 鉛灰色 400~500 較薄 高 小 銀灰或銀白 500~700 適中 好 好 米黃、金黃 700~1000 較厚 低 好 紫色 (藍(lán) ) 1000以上 不能 用 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 展片、撈片 超切注意事項(xiàng) ⑴ 切片是否成功，對(duì)刀是關(guān)鍵 ⑵ 槽液用新鮮的重蒸水 ⑶ 切片時(shí)的溫度 20~25℃ ，相對(duì)濕度 60%， 室內(nèi)無(wú)空氣流動(dòng)，清潔，防止震動(dòng) ⑷ 不損壞封固刀槽的石蠟 ,否則漏水 切片缺陷產(chǎn)生的原因及排除方法 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 六、電子染色 1. 電子染色 (Electron Staining) 1) 概念 : 利用高密度的重金屬染色劑（鉛、鈾）與細(xì)胞某些微細(xì)結(jié)構(gòu)或成分結(jié)合，以增加樣品局部的電子散射能力，提高電鏡圖像反差的方法。 2) 原理： 結(jié)合重金屬多的區(qū)域， △ ?t大 → 電子散射 能力強(qiáng) → 電子密度大 → 圖像深暗 反之 ….. 生物電子顯微技術(shù) 常用染色劑 (Pb,U鹽） 1)鈾鹽 ：醋酸鈾（醋酸雙氧鈾） UO2(CH2COO)22H2O 特點(diǎn) : ，可以提高核 酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織的反差，對(duì)膜的染色差 ，發(fā)射熒光，有毒，見(jiàn)光分解 配方及染色 A. 常用 1－ 5％的醋酸雙氧鈾，室溫下染色30min－ 1h； 4070℃ 用時(shí) 20－ 30min. B. 12%醋酸雙氧鈾的 50%， 70％或 95％的乙醇溶液，穿透力強(qiáng)， 20－ 30min. 生物電子顯微技術(shù) 2)鉛鹽 ： 檸檬酸鉛（枸櫞酸鉛） 特點(diǎn)： A、 密度大，對(duì)細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)都有親和力， 尤其提高細(xì)胞膜系統(tǒng)和脂類(lèi)物質(zhì)的反差， 對(duì)核糖體、糖元等著色。常用 B、 鉛鹽毒性大（防止皮膚吸收引起鉛中 毒），易與 CO2產(chǎn)生沉淀 3)高錳酸鉀 (KMnO4): 對(duì)膜染色好，與鈾鹽配合使用，當(dāng) MNA做硬化劑 的環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑制作超切時(shí)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 方法： 1％的 KMnO4室溫下染色 10min 生物電子顯微技術(shù) 染色的方法 : : 鉛鹽單染 ,鈾鹽單染 鉛鹽比鈾鹽好 ,注意 CO2的干擾 : ① 醋酸雙氧鈾前染 20～ 30min ② 漂洗掉多余染液 ③ 檸檬酸鉛后染， 15min 生物電子顯微技術(shù) 返回 生物電子顯微技術(shù) 返回 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 思考題 : 超薄切片 半薄切片 脫水 固定 緩沖液 電子染色 包埋 2. 簡(jiǎn)述普通超薄切片樣品制備技術(shù)的基本過(guò)程 . 3. 超薄切片機(jī)的基本構(gòu)造及其工作原理。 4. 為什么要用支持膜 ?支持膜有哪些種類(lèi) ?其特 點(diǎn)是什么 ? 5. 什么是半薄切片 ?為何要制作半薄切片 ? 生物電子顯微技術(shù) 6. 超薄切片時(shí)為什么要采用雙固定法 ? 7. 簡(jiǎn)述包埋塊修整的要求及原因 . 8. 何謂合格的超薄切片 ? 9. 提高電鏡的反差有哪些 ? 10. 超切中哪些步驟可以停留過(guò)夜 ? 11. 為何要對(duì)超切進(jìn)行電子染色 ? 常用的電子染色有哪些 ?
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