《超薄切片技術(shù)》ppt課件 (2)-文庫(kù)吧
2025-04-19 13:17 本頁(yè)面
【正文】 強(qiáng)，穿透速度快，能迅速達(dá)到組織塊的各部位，立即殺死細(xì)胞，以盡量減小死后變化 2） 穩(wěn)定細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，使各種結(jié)構(gòu)成分凝固或變性，以保證后續(xù)的各種處理中物質(zhì)不溶 解、不丟失 3） 使細(xì)胞不變形，保持各種結(jié)構(gòu)生活時(shí)形狀，不產(chǎn)生人工假象，以保證電鏡圖像的真實(shí)性。 4) 能保存一定的酶活性 ,以供細(xì)胞化學(xué)的測(cè)定 5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用 （二）常用的固定劑 常用、理想固定劑應(yīng)具備的條件 生物電子顯微技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)： ⑴ 幾乎和細(xì)胞內(nèi)所有成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合 ⑵ 對(duì)氮具有較強(qiáng)親和力，對(duì)含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定作 用良好 ⑶ 可保存脂肪 ,形成脂肪 鋨復(fù)合物 ⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 對(duì)磷脂蛋白、核蛋白保護(hù)很好 理想固定劑 1）鋨酸（ OsO4) 生物電子顯微技術(shù) 鋨酸缺點(diǎn)： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，對(duì)微管固定效果差 ⑵ 酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)研究 ⑶ 分子量大 ,滲透能力差，要求組織塊小 ⑷ 固定時(shí)間不宜過長(zhǎng) ⑸ 可與乙醇、醛類氧化還原反應(yīng)生成沉積 ⑹ 有揮發(fā)性、劇毒 生物電子顯微技術(shù) 2）戊二醛 （ C5H8O2） 優(yōu)點(diǎn)： ⑴ 固定迅速，樣品塊可以大于 1mm3 ⑵ 能保存糖元、蛋白質(zhì)、核蛋白，核酸，尤其對(duì)微 管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等固定效果最好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有較 強(qiáng)的親和力 ⑶ 可長(zhǎng)時(shí)間固定（ 7天），適于野外取材 ⑷ 不易使酶失活，適于細(xì)胞化學(xué)研究 ⑸ 不揮發(fā)，但容易經(jīng)皮膚吸收，對(duì)呼吸道粘膜有 刺激性 生物電子顯微技術(shù) 戊二醛缺點(diǎn) ： ⑴ 不保存脂肪 ⑵ 無(wú)電子染色作用 ⑶ 對(duì)緩沖液的要求嚴(yán)格 很差 很好 糖元 良好 很好 好 鋨酸 很差 很好 尚好 戊二醛 脂類 核蛋白 蛋白質(zhì) 固定劑 不強(qiáng) 有 小 很差 強(qiáng) 無(wú) 大 較好 對(duì) BS的選擇性 電子染色 滲透 核酸 四氧化鋨與戊二醛的固定作用比較 鋨酸 戊二醛 固定劑 生物電子顯微技術(shù) 雙固定法 ：指用戊二醛對(duì)樣品前固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后固定，這種使用兩種化學(xué)試劑分別前后對(duì)樣品進(jìn)行固定的方法稱為雙固定法。 3) 甲醛 （ HCHO） ：甲醛＋戊二醛 滲透速度快、固定迅速，對(duì)酶活 性的保護(hù)優(yōu)于 戊二醛，經(jīng)濟(jì)方便 4) 高錳酸鉀 （ KMnO4) 磷脂蛋白，對(duì)神經(jīng)髓脂質(zhì)很好，細(xì)胞膜性結(jié) 構(gòu)、葉綠素固定良好。 生物電子顯微技術(shù) 緩沖液 ：一種仿效細(xì)胞外液成分，對(duì)細(xì)胞富有生理保護(hù)功能的溶液 緩沖液主要作用 ⑴ 維持穩(wěn)定的 pH值 ⑵ 提供適當(dāng)?shù)臐B透壓 ⑶ 提供適當(dāng)?shù)碾x子成分使樣品不抽提，不沉淀 附加劑： 187。 調(diào)節(jié)滲透壓， NaCL, CaCL2， 蔗糖，葡萄糖 （三）緩沖液和附加劑 生物電子顯微技術(shù) 儲(chǔ)備 A液 ():磷酸氫二鈉 () 1000ml 儲(chǔ)備 B液 ():磷酸二氫鈉 () 1000ml （ PBS）， 由儲(chǔ)備 A液 ()和儲(chǔ)備 B液()按上表比例合成，然后稀釋定容到 100ml。 優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，便宜，易于大量配置 缺點(diǎn)： 易產(chǎn)生沉淀，不穩(wěn)定，易受到細(xì)菌污染 pH（ 25。C） A液 5 24.5 B液 5 5 25.5 ⑴ ． 磷酸鹽緩沖液 常用緩沖液 生物電子顯微技術(shù) ⑵ ． 巴比妥鹽 對(duì)鋨酸適用，戊二醛不能，不長(zhǎng)期保存 ⑶ ． 二鉀胂酸鹽 可長(zhǎng)期保存，有毒，有臭味 （四）、固定 固定液的配制 生物電子顯微技術(shù) ⑴ 單固定： 戊二醛或鋨酸單次固定 1～ 3小時(shí) ⑵ 雙固定： 前固定（戊），漂洗，后固定（鋨） ⑶多重固定： 用三種以上的固定劑對(duì)樣品進(jìn)行固定 固定的方法 1）按固定液的成分劃分為 ： 2）按固定方式分為 ： a. 浸泡固定 b. 體外固定 c. 原位固定 d. 灌流固定 生物電子顯微技術(shù) 固定操作示意圖 生物電子顯微技術(shù) 漂洗操作方法 生物電子顯微技術(shù) 1) 固定液的濃度 :戊二醛 15%,鋨酸 13% 濃度低 → 固定時(shí)間長(zhǎng) → 細(xì)胞質(zhì)的抽提 ,組織腫脹 濃度高 → 易損細(xì)胞微結(jié)構(gòu) ,OsO4或 KMnO4可使蛋 白質(zhì)分子氧化而斷裂 2) 固定液的滲透壓： 滲透壓低 → 細(xì)胞器或整個(gè)細(xì)胞膨脹 滲透壓高 → 細(xì)胞收縮 3) pH值：植物 ～ ,動(dòng) ～ 4) 固定的溫度： 0～ 4℃ 但低溫對(duì)細(xì)胞微絲、微管有害 5) 組織塊的大小： ～ 1mm3 6) 固定液的用量，一般為組織塊的 500倍 固定注意事項(xiàng)： 生物電子顯微技術(shù) 三 脫水 (dehyd
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