蛋白質(zhì)化學ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-05-31 12:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 (四 ) 根據(jù)吸附性質(zhì)不同的分離方法 吸附層析法（吸附色譜法）： 某些物質(zhì)對不同種類的蛋白質(zhì)具不同程度的吸附能力。 利用這種 吸附能力的差異 ，可以將蛋白質(zhì)進行分離。 蛋白質(zhì)提純中應用最廣的吸附劑是 結晶磷酸鈣 。 洗脫液為不同濃度和不同 pH的 磷酸緩沖溶液 。 (五 ) 根據(jù)配體特異性的分離 —— 親和層析 ?親和色譜法 （ Affinity chromatography） —是一種高效分離純化蛋白質(zhì)的方法 ? 在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的 配基 ，這些配基可以與流動相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結合而進行分離的一種方法，稱之為 親和層析 。 ? 配基 是指能被生物大分子識別并與之結合的原子、原子團和分子。用游離的相應 配體溶液 進行洗脫。 親和層析法的原理 ? 將某種配基與載體共價連接。當含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過色譜柱時，該 蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結合 而被吸附在色譜柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。 ? 被結合的蛋白質(zhì) ，可以用適當?shù)南疵撘合础? ? 常用配基： 抗體、抗原、激素、或受體蛋白等。 ? 色譜柱載體 ：瓊脂糖凝膠等。 親和層析法的步驟 總結：蛋白質(zhì)的分離純化的方法 ? 透析、超濾 ?根據(jù)性質(zhì)： 分子大小 ? 鹽析（ salting out） ?根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的沉淀 ?作用機理：中性鹽中和表面電荷，破壞水化層 ?影響因素： 表面電荷、水化層、溶劑性質(zhì) ? 超速離心： 分子大小及形狀 、溶液特性 ? 電泳： ? 根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的兩性解離 ? 作用機理：異性電荷互相吸引 ? 影響因素： 電荷種類及數(shù)量、分子大小及形狀 、 溶液離子強度及 pH等 ? 層析 ? （ 1）分子篩（凝膠過濾層析）： 分子大小及形狀 ? （ 2）離子交換層析： 電荷、分子量、分子形狀 ? （ 3）吸附層析： 吸附特性 ? （ 4）親和層析： 生物特性 三、蛋白質(zhì)的分析測定 酚試劑法 凝膠電泳 N末端分析 等 含量測定 純度鑒定 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定 ? 化學測定法、超離心沉降速度法 ? 凝膠過濾法、 SDSPAGE ? 化學組成法 ? 利用化學分析，定量測定蛋白質(zhì)中某一 特殊元素的含量 ，并假定蛋白質(zhì)中，只含有一個這種元素的原子，即可算出蛋白質(zhì)的最低分子量： 100 = 16700 分析血紅蛋白中含鐵量為 %，則血紅蛋白最低分子量為： （ ） 后來用別的方法測得血紅蛋白實際分子量為 67000，由此可知，血紅蛋白含有四個鐵原子 。 超離心沉降速度法 ? 沉降系數(shù) (sedimentation coefficient， S)：一種顆粒在單位離心力場中沉降速率為恒定值，用 s表示。 ? 將蛋白質(zhì)溶液放在超速離心機的離心管中進行超速離心。由于超過重力幾十萬倍的離心力的作用，而使蛋白質(zhì)分子沉降下來。 ? 大小和形狀 都相同的蛋白質(zhì)分子 下沉速度 相同，在離心管中產(chǎn)生一個明顯的界面，利用光學系統(tǒng)可以觀察到此界面的移動，從而測得蛋白的沉降速度。 ? 凝膠過濾法： 在層析柱中裝入 葡聚糖凝膠 顆粒。這種凝膠顆粒具有多孔的網(wǎng)狀結構。這些網(wǎng)孔只允許 較小的分子進入顆粒內(nèi) ，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當用洗脫液洗脫時，被排阻的相對分子質(zhì)量大 的分子先被洗脫下來，相對分子質(zhì)量小的分子后下來。 凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)Mr 凝膠過濾法的計算方法 ? 將 3種以上相對分子質(zhì)量有較大的差異的標準蛋白質(zhì)制成混合溶液，經(jīng)上柱和洗脫，根據(jù)洗脫峰的位置 ，量出各種蛋白質(zhì)的洗脫體積。 ? 此法僅適用于 球狀分子的相對分子質(zhì)量測定。 ? S
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