凝膠層析ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 18:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 分的各管流出物，得到分子量不同的各種組分 當 Kav=0時 ，則 Ve=Vo，即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì) 全排阻 ，洗脫體積等于空隙體積即外水體積（圖中組分 Ⅰ ） 當 Kav=1時 ， Ve=Vo+Vi 即小分子可 完全滲入凝膠內(nèi)部 時，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)水體積之和。 Ve=Vo+Vi（圖中組分 Ⅲ ） 當 0＜ Kav＜ 1時 ， Ve=Vo+ Kav（ Vi ＋ Vg ）。 表示固定相中只有 一部分 可被組分擴散 滲入 ， 一部分被排阻 ， Ve即在Vo與 Vo+Vi＋ Vg之間變化（圖中組分 Ⅱ ）有時 Kav＞ 1， 表示凝膠對組分有吸附作用 （ 從內(nèi)水中洗脫出來的含量下降），此時 Ve＞ Vo+Vi＋ Vg。 例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在 Sephadex G25中的洗脫體積遠超出理論計算的最大值10．膨脹度 在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分 溶脹 后所占有的體積用 Vβ 表示。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。 Vβ=Vt/g 一般 親水性 基質(zhì)的膨脹度比 疏水性 的 大 。 三 .凝膠層析的特點 （一）優(yōu)點其結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定 ,所以凝膠 本身不與樣品發(fā)生化學反應(yīng)。 操作條件較溫和 ,不易引起生物物質(zhì)的變性 ,即使用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。 ,重復(fù)性好 .如果按比例擴大柱的體積和高度 ,可進行大量樣品的分離純化。（二）缺點 樣品和洗脫液的 粘度很低 。 孔徑大小非常有限 ,所以可被純化的物質(zhì)的 分子量范圍受到限制 。 對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用 ,如芳香族化合物與脂蛋白等。四 .凝膠的結(jié)構(gòu)與性能 （商品名為 Sephadex）結(jié)構(gòu)： 葡聚糖用交聯(lián)劑 1氯代 2 ,3環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵 (COCH2CHCH2O)交聯(lián)聚合而成的 三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。OH1.特點： Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度 ,交聯(lián)度的大小可在合成 Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定 .交聯(lián)劑的百分比高 ,交聯(lián)度大 ,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密 ,孔隙愈小 ,吸水后膨脹也愈小 ,機械強度高 ,分離物質(zhì)的分子量也小。 反之 ,交聯(lián)劑的百分比低 ,分離物質(zhì)的分子量大。 G類 Sephadex的型號表示 每克干凝膠吸水量 x10,如 G50表示每克干凝膠吸水量為 5ml。Sephadex的 化學性質(zhì)穩(wěn)定 ,不溶于水、鹽、弱酸和堿 ,耐熱耐堿不耐酸 。 2．穩(wěn)定性 葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學降解。 在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可置高溫(120℃) 消毒 ，其性質(zhì)并不改變。在 L HCl溶液中浸泡 12h，甚至在 ／ L HCl溶液中浸泡 6個月以上，對分離效果無明顯的影響。 但是，當暴露于 強酸或氧化劑 溶液時，則容易使 糖苷鍵水解斷裂 ，因此，要避免與其接觸。 3．吸附性 葡聚糖凝膠系 弱酸性 物質(zhì)、這是由于其每克干膠含 10－ 20ug當量的羧基基團所致。該基團能與分離物中電荷基團 (尤其是堿性蛋白質(zhì) )發(fā)生 吸附作用。當離子強度大于 ，一般對弱堿性蛋白質(zhì)就無吸附力了。因此進行葡聚糖凝膠層析時，常用 含有 NaCl的緩沖液作洗脫液。 （商品名為 Sepharose)它是一種 大孔凝膠 ,其工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限 ,可分離 MW40 萬以上 的物質(zhì) ,因此可用來分離核酸及病毒。瓊脂糖凝膠不帶電荷 ,不受微生物作用而降解 ,但對熱不穩(wěn)定 ,易受 pH影響 (只在 范圍內(nèi)穩(wěn)定 . 瓊脂糖凝膠的 機械強度和篩孔的穩(wěn)定性 都比葡聚糖凝膠好，分離范圍大。用瓊脂糖凝膠進行柱層析時，流速可以快些。 最好使用條件控制在 pH 4～ 9之間，溫度 0～40℃ ， 超出此范圍 ,可能被破壞。瓊脂糖凝膠規(guī)格 瑞典和國產(chǎn)的產(chǎn)品有 3種規(guī)格：Sepharose2B、 4B、 6B分別表示瓊脂糖濃度為 2% 、 4% 、 6% 。 美國的為 Bio－ GA，有 6個型號 :即 BioG， ， 5M， 15M， 50M和150M。 阿拉伯數(shù)字乘以 106表示排阻限度。 使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似 ,但化學性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定 ,可在 pH211范圍內(nèi)使用 .聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－ P（ BioGelP），由美國 BioRod廠生產(chǎn)，型號很多，從 P2至 P300共 10種， P后面的數(shù)字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。 聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)單體丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺 一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，使用時必須溶脹。 穩(wěn)定性： 該凝膠不溶于水和普通有機溶劑，能忍受
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