紫外可見光譜與熒光光譜(編輯修改稿)
2025-05-29 02:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系的化合物。 ? 如果在 210～ 250nm有強(qiáng)吸收，則可能含有兩個(gè)雙鍵的共軛體系，如共軛二烯或 α， β不飽和酮等。同樣在 260， 300，330nm處有高強(qiáng)度吸收帶，在表示有三個(gè)、四個(gè)和五個(gè)共軛體系存在。 ? 如果在 260～ 300nm有中強(qiáng)吸收（ ε＝ 200～ 1 000），則表示體系中可能有苯環(huán)存在。如果苯環(huán)上有共軛的生色基團(tuán)存在時(shí)，則 ε可以大于 10 000。 ? 如果在 250～ 300nm有弱吸收帶則可能含有簡單的非共軛并含有 n電子的生色基團(tuán)，如羰基等。 2 純度檢測 如果有機(jī)化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，則可利用紫外光譜檢驗(yàn)化合物的純度。如果有機(jī)化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，則可利用紫外光譜檢驗(yàn)化合物的純度。 在相同條件下配制樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在最佳波長 λ最佳處測得二者的吸光度 A樣和 A標(biāo)，進(jìn)行比較，按式計(jì)算樣品溶液中被測組分的濃度。 標(biāo)標(biāo)樣 cAcX ?? A 比較法 標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 λ最佳處分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 A，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在完全相同的條件下測定試液的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試液的濃度。該法適用于大批量樣品的測定。 3 定量分析 朗伯 比爾定律 朗伯 比爾定律是紫外 可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的理論基礎(chǔ)，它的數(shù)學(xué)表達(dá)式為 : A = ε l c 4 氫鍵強(qiáng)度的測定 溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時(shí)，對溶質(zhì)分子的 UV光譜有較大的影響。對于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中 吸收帶 的差別，可以近似測定氫鍵的強(qiáng)度。溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時(shí)，對溶質(zhì)分子的 UV光譜有較大的影響。對于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測定氫鍵的強(qiáng)度。 紫外 /可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用 ? 濃度測定 ? 構(gòu)象變化研究 ? 相互作用研究 蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收 ? 肽鍵在 250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收 蛋白質(zhì)濃度測定 ? ?190nm? 10000 l/ ? ?190nm比 ?280nm大 ~100倍 ? 但溶劑吸收也較大 溶劑的吸收 蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜 1mM 二硫鍵在 250 nm附近有弱吸收 色氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù) ? 可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測蛋白質(zhì)的消光系數(shù) ProtParam: Tyr的吸收譜與 pH有關(guān) ? pH titration can be used to determine whether Tyr is internal or external polarity of environment ?max at pH 6: 274 nm ?max at pH 13: 295 nm 蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究 Absorption spectra of PolyLLys HCl: random coil at pH , 25186。C(bold)。 ?Helix at pH , 25186。C(dotted)。 ? strand at pH , 52186。C(dashed). 蛋白質(zhì)折疊 /變性研究 核糖核酸酶 熒光法的應(yīng)用 ? 熒光法靈敏度高 ， 檢測限比吸收光譜法低 1~3個(gè)數(shù)量級(jí) ，可用于痕量分析 。 ? 選擇性好 ， 由于能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多 。 ? 線性范圍寬。 ? 應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光。 Environmental Sensitivity ? Fluorophores can be affected by a large number of environmental factors including such parameters as pH, ionic strength, noncovalent interactions, light intensity, temperature and so on. ? Both the excitation and emission wavelengths and the quantum yield can all be changed by environmental factors. 溫度 ? 熒光一般隨溫度上升而減弱 ? 熒光實(shí)驗(yàn)需要恒溫 Protein intrinsic fluorescence Trp fluorescence can be selectively excited at 295305 nm. (to avoid excitation of Tyr) Trp fluorescence is very sensitive to its local environment It is possible to see changes in emission spectra in response to conformational changes, subunit association, substrate binding, denaturation, and anything that affects the local environment surronding the indole ring. Also, Trp appears to be uniquely sensitive to collisional quenching, either by externally added quenchers, or by nearby groups in the protein. Fluorescence of tryptophan depends upon the dipolar nature of the solvent Caparvalbumin: tryptophan is buried, 305 nm Cafree parvalbumin: tryptophan is exposed to solvent Tryptophan in various solvents: hexane, trehalose
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1