cdna測序和表達(dá)譜研究(編輯修改稿)
2025-05-26 02:35 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 f Genomes and their Expression) 該協(xié)會由美國和法國的 4個研究機(jī)構(gòu)組成， 目的是收集所有的 EST克隆和順序，并且這些克隆可以提供給研究人員。 大量獲得全長 cDNA的策略 構(gòu)建富含全長 cDNA的文庫和電腦克隆 ① 構(gòu)建富含全長 cDNA的文庫。 如何獲得低豐度、長的以及含有特殊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物成為難題。 cDNA的文庫構(gòu)建方面有了較大的進(jìn)展： A. 文庫構(gòu)建所用的反轉(zhuǎn)錄酶和 Taq酶，其忠實性能和延伸性能有了很大改善，所構(gòu)建的 cDNA的文庫含有全長 cDNA的克隆超過 50％，其長度超過 3kb， 甚至 7kb。 。 B. 根據(jù) 5’轉(zhuǎn)錄帽狀結(jié)構(gòu)所設(shè)計的特殊 cDNA構(gòu)建策略，其全長 cDNA的比例較高。 ，除對來自各種組織、細(xì)胞的cDNA文庫測序外，采取步驟去除已知的或已測過的順序，如用已知的序列去雜交或吸附等方法處理 cDNA文庫，以增加低豐度的轉(zhuǎn)錄物被測序機(jī)會。 也可以先用寡核苷酸指紋印跡法對欲測文庫進(jìn)行均一化處理 大規(guī)模全長 cDNA測序方法 要求： ① cDNA文庫質(zhì)量更高，插入子大小最好在 3～ 4kb以上。 ② 測序質(zhì)量高，精度在 ％。 ③ 測序從 5’和 3’同時進(jìn)行。 若不能貫通， (primerwalking)法解決 但引物步移對工作人員素質(zhì)要求較高，并要求有 DNA合成儀合成大量引物。 B. 用鳥槍法 (shotgun)或轉(zhuǎn)座子法測序，測序后通過計算機(jī)拼接。該方法，易于流水線操作，不增加新的平臺技術(shù)。 ②電腦克隆全長 cDNA 與 UniGene的構(gòu)成非常類似， 也是應(yīng)用序列相似性進(jìn)行排列組合。 不同之處： 除充分利用 EST數(shù)據(jù)外， 還要利用基因組 DNA序列基因預(yù)測結(jié)果。 電腦克隆時，需要與上述核苷酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較分析以確定是否可能含有全長的 ORF。 若同源性較高，則易判斷； 若同源性較低或沒有同源性，則較難確定。此時，在保證順序正確的同時，對翻譯的順序進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域和比較基因組分析，可幫助確定是否含有 ORF。 cDNA末端快速擴(kuò)增法 (RACE) 快速克隆全長 cDNA方法的有效補(bǔ)充 原理： 利用 PCR方法對 cDNA所缺少的 5’或 3’端進(jìn)行延伸和擴(kuò)增。 設(shè)計與部分 cDNA互補(bǔ)或一致的引物，在可能高表達(dá)的cDNA庫中進(jìn)行 5’或 3’端延伸、擴(kuò)增。 組合后，可能獲得全長 cDNA。 ? 電腦克隆和 RACE的方法并不能直接獲得克隆，可能有錯誤。 ? 必須進(jìn)行高保真的 RTPCR擴(kuò)增并亞克隆至質(zhì)粒，再次測序以驗證克隆的正確。 全長 cDNA在克隆過程中和克隆后，尤其重要。 互聯(lián)網(wǎng)上可以利用的信息： 軟件：比較基因組軟件 COG， 基因組庫 GDB和遺傳病表型庫 OMIM等。 與核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較 : ① 可以提示所獲順序是否新基因，是否一個基因家族的新成員，是否在生物進(jìn)化過程中保守。 生物信息學(xué)分析 ② 利用結(jié)構(gòu)功能域 (domain)、 基序 (motif)及二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，可以提供新基因是否有功能相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu)，是否分泌蛋白、受體、信號傳導(dǎo)分子、酶及轉(zhuǎn)錄因子等有關(guān)信息，為進(jìn)一步研究提示方向。 ③ 電子組織表達(dá)譜是利用與新基因相匹配的 EST來源，推測新基因組織表達(dá)分布，具有一定意義。 ④ 利用 UniGene和序列標(biāo)志位點(diǎn) (sequence tag site， STS)對新基因進(jìn)行染色體定位，為克隆疾病相關(guān)基因提供了資源。 二、基因表達(dá)譜 (一 )基因表達(dá)譜的概念 結(jié)構(gòu)基因組：基因組的結(jié)構(gòu)特征和序列信息。 但：人體細(xì)胞、組織，在不同的發(fā)育、分化階段，不同的生理條件和病理狀態(tài)下，其表達(dá)的基因種類以及每一基因的表達(dá)豐度都是各不相同的，且此差別存在嚴(yán)格調(diào)控的時空特異性。 生命過程的精確機(jī)制很大程度上正是基于基因的精細(xì)調(diào)控，許多生命現(xiàn)象的深層次問題都集中于此。 基因表達(dá)譜 (gene expression profile) 概念： 通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性 cDNA文庫，大規(guī)模 cDNA測序，收集 cDNA序列片段，定性、定量分析其 mRNA群體組成，從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息，這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜。 即： 特定狀態(tài)； 分析所有的基因表達(dá)； 得到基因表達(dá)種類和豐度表。 表達(dá)譜的意義和作用 ① 從 mRNA水平反映細(xì)胞或組織特異性表型和表達(dá)模式。 ② 如果收集各類組織和細(xì)胞的基因表達(dá)譜，將每一個表達(dá)的基因標(biāo)記到其表達(dá)的組織，就能組成一張人體基因圖； ③ 對基因表達(dá)譜作兩兩或多重比較，就能篩選出細(xì)胞特異性或發(fā)育階段特異性的基因。 ④ 系統(tǒng)、全面地了解發(fā)育、分化、進(jìn)化和衰老等基本生命現(xiàn)象，以及腫瘤、心血管疾病等危害人類健康的重大疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識。 大規(guī)模基因表達(dá)檢測技術(shù) ① 微陣列法 (microarray) ② DNA芯片 ③ SAGF(serial analysis of gene expression) 。 優(yōu)點(diǎn)：定性、定量、大規(guī)模地檢測基因的表達(dá)產(chǎn)物 mRNA， 并繪制基因表達(dá)譜。 (
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