【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。 4 簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一般步驟？大量培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法有哪些？ 培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的一般步驟 : 取出目的細(xì)胞所在組織→ 洗凈 → 切成小組織塊 → 解離液中離散細(xì)胞 → 洗滌細(xì)胞 → 目的細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 大量培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的三種方法 : ①微導(dǎo)管培養(yǎng)法 由硝酸纖維素或醋酸纖維素制外徑小于 l mm 的多層微導(dǎo)管床浸沒(méi)于培養(yǎng)基中。管內(nèi)的無(wú)菌空氣經(jīng)擴(kuò)散可進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)液中，動(dòng)物細(xì)胞貼附生長(zhǎng)于微導(dǎo)管表面，細(xì)胞密度達(dá) 100 萬(wàn)個(gè) /cm2。 ②微載體培養(yǎng)法 以葡萄糖聚合物或其他聚合物制成與培養(yǎng)基比重基本相等的直徑從幾十微米到幾百微米的固體小珠 —— 微載體。 ③微膠囊培養(yǎng)法 將動(dòng)物細(xì)胞與大約 4%的褐藻酸鈉混合后，滴到 CaCl2 溶液中，制成半透性微膠囊。 5 細(xì)胞融合常用的方法有哪些？各有什么優(yōu) 缺點(diǎn)？ 仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段： ①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在 4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚； ②在 37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要 Ca2+和 Mg2+，最適 PH 為 一 ； ②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需 Ca2+和 ATP； ④融合成巨大細(xì)胞，仍需 ATP 。 （ PEG）法 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。 電融合法的優(yōu)點(diǎn)： 1)融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害小； 2）裝置精巧、方法 簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程； 3）免去 PEG 誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。 6 簡(jiǎn)述胚胎移植的程序。 供體和受體的選擇 超數(shù)排卵處理 供體母畜的配種 胚胎的收集 胚胎的檢查 胚胎的保存與培養(yǎng) 供體和受體的術(shù)后觀察 7 簡(jiǎn)述核移植操作的一般程序。 核移植克隆哺乳動(dòng)物的技術(shù)操作過(guò)程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（ 寄母）等步驟 。 1．核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備 去核卵母細(xì)胞常常作為核移植的受體細(xì)胞。這是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過(guò)程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開(kāi)始個(gè)體發(fā)育過(guò)程。 卵母細(xì)胞的來(lái)源有兩種方式：一是用激素對(duì)雌體進(jìn)行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的 MⅡ卵母細(xì)胞。二是從屠宰場(chǎng)收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘 — 卵母細(xì)胞復(fù)合體 (COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。 2．核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備 在核移植操作中，細(xì)胞核供體細(xì)胞首 先必須是完整的二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動(dòng)物完整的基因組；其次，供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過(guò)程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個(gè)正常動(dòng)物個(gè)體的全過(guò)程。 供體細(xì)胞主要有兩大類(lèi)：胚胎卵裂球和體細(xì)胞。另外，核供體細(xì)胞的來(lái)源還有胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。 3． 細(xì)胞核移植 常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。 即 通過(guò)電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細(xì)胞從 MII 期中解放出來(lái)，并轉(zhuǎn)到?受精?的狀態(tài)。 5．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng) 經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。 6．胚胎移植 重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。 8 核移植技術(shù)的應(yīng)用哪些領(lǐng)域？核移植技術(shù)意義和存在的問(wèn)題？ 應(yīng)用： 1） 制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物， 進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)； 2） ．培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群 ； 3） 開(kāi)展異種動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物； 4） 與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開(kāi)展治療性克隆 5） 利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問(wèn)題 。 重要生物學(xué)意義：第一，它證明了一個(gè)已經(jīng)完全分化了的動(dòng)物體細(xì)胞仍然保持著當(dāng)初胚胎細(xì)胞的全部遺傳信息，并且經(jīng)此技術(shù)處理后，體細(xì)胞恢復(fù)了失去的全能性形成完整個(gè)體。 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳動(dòng)物體細(xì)胞作為供體細(xì)胞繁殖的克隆羊，即成體母羊的復(fù)制品。它的成功提示我們可以進(jìn)一步做到，在培育體細(xì)胞成為核供體之前，利用?基因靶?技術(shù)精確地誘發(fā)核基因的遺傳改變或精確地植入目的基因，再用選擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些產(chǎn)生了令人滿意變化的細(xì)胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。也就是 說(shuō)，我們可以按照人的意志去改選、生產(chǎn)物種。 第三，在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中， 沒(méi) 有任何一項(xiàng)研究成果能夠比通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行有規(guī)律地控制而解決更多的問(wèn)題的先例。多利羊的誕生及生長(zhǎng)表明，利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳類(lèi)動(dòng)物的最后技術(shù)障礙已被突破，在理論上已成為可能。 克隆技術(shù)存在的問(wèn)題 理論問(wèn)題 ： a 分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過(guò)程）的機(jī)理還不清楚； b 克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡。 c 克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因。 d 在克隆過(guò)程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問(wèn)題還沒(méi)有解決。 實(shí)踐問(wèn)題 ： a 克隆動(dòng)物的成功率還很低 b 生出的部分個(gè)體表現(xiàn)出生理或免疫缺限 ， 早衰跡象 9 利用已學(xué)的干細(xì)胞知識(shí)，論述干細(xì)胞在人類(lèi)健康中的作用 （一）治療方面 ： 作為細(xì)胞治療與組織器官替代治療的種子細(xì)胞 ； 作為疾病基因治療的載體 （二）研究方面 ： 探討胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)制 ； 利用胚胎干細(xì)胞體外整合外源基因，研究基因功能及與疾病的關(guān)系 ； 藥物篩選平臺(tái)的建立，藥理研究與新藥開(kāi)發(fā) 干細(xì)胞治療研究及臨床應(yīng)用 ： 1）臨床前研究和臨床試驗(yàn)： 神經(jīng)干細(xì)胞 : 中風(fēng) , MS, ALS, 腦癱 ,癡呆，記憶力喪失，腦外傷，脊髓損傷，失明 間充質(zhì)干細(xì)胞 : 腎臟、肝臟、胰腺和腦損傷，腸道疾病，骨關(guān)節(jié)病 肝 /胰腺干細(xì)胞 : I 型和 II 型糖尿病，肝炎和肝病，肝癌 造血干細(xì)胞：貧血，骨髓疾病，免疫系統(tǒng)疾病，慢性感染，狼瘡，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 皮膚干細(xì)胞：燒傷，皮膚移植，皮膚疾病 肌肉干細(xì)胞：肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，心肌病，心臟病發(fā)作造成的損傷 肺細(xì)胞干細(xì)胞：肺氣腫，肺部疾病 2） 臨床應(yīng)用： 造血干細(xì)胞移植（白血病、淋巴瘤） 結(jié)合胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、干細(xì)胞與糖尿病治療、干細(xì)胞與心臟病治療、干 細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、干細(xì)胞治療帕金森病、干細(xì)胞與脊髓損傷、干細(xì)胞與基因治療、腫瘤干細(xì)、急性髓性白血?。?AML)、腦腫瘤 、乳腺癌 、結(jié)腸癌 、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腦腫瘤回答（自由發(fā)揮） 10 腫瘤干細(xì)胞的起源有哪些？研究腫瘤干細(xì)胞有哪些意義？ 腫瘤干細(xì)胞（ CSCs)是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞的起源 — 基因突變 、細(xì)胞融合。腫瘤干細(xì)胞的意義：針對(duì)預(yù)防和治療腫瘤干細(xì)胞的臨床干預(yù)措施 a 降低風(fēng)險(xiǎn)：多酚，如異黃酮；b 早期檢測(cè)：檢測(cè)增值的干細(xì)胞及分泌的分子標(biāo)記物，如 EZH2； c 預(yù)防： 促進(jìn)干細(xì)胞的凋亡雨分化，如維生素 D； d 治療：常規(guī)療法； e 靶向腫瘤干細(xì)胞的治療，如γ分泌酶抑制劑 11 什么是 iPS 細(xì)胞？簡(jiǎn)述 iPS 細(xì)胞的應(yīng)用前景。 即 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 ， 是將體細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因改造轉(zhuǎn)化為具有多向分化潛能和自我更新能力的人造干細(xì)胞。 iPS 細(xì)胞的應(yīng)用前景 ： 核移殖技術(shù)、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、干細(xì)胞與基因治療（參考）。利用iPS 細(xì)胞在疾病模型中進(jìn)行細(xì)胞替代治療：鐮刀形細(xì)胞貧血癥、血友病 A、帕金森病、急性心肌梗死、糖尿病利用 iPS 細(xì)胞還原疾病的病理過(guò)程、提供體外疾病模型、以及建立特異性 iPS 細(xì) 胞系。 日本首次成功把人皮膚成纖維細(xì)胞改造成類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞 。 第四章 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)思考題 1 蛋白質(zhì)分離與純化包括哪幾個(gè)步驟？ 材料的選擇與預(yù)處理 確定有效成分含量測(cè)定方法 細(xì)胞的破碎 （機(jī)械破碎；溶脹和自溶；化學(xué)處理、生物酶降解） 提取 純化（包括鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、有機(jī)溶劑萃取、吸附、層析、超速離心及結(jié)晶等） 濃縮、干燥及保存 2 確定樣品中蛋白質(zhì)有效成分的方法有哪些？ 分光光度計(jì)、熒光分析法、生物活性測(cè)定、電泳分析、化學(xué)分析法、免疫分析法 3 影 響蛋白質(zhì)抽提效果的因素有哪些？ 1） PH 值 2） 溶劑的極性和離子強(qiáng)度 3） 水解酶（加入抑制劑、調(diào)節(jié)抽提液 PH、離子濃度或極性） 4）溫度（ HCG、尿苷丙酮酸羧化酶） 5） 攪拌 6） 金屬離子（重蒸水、 EDTA、 5:1） 7） 氧化（ 2巰基乙醇、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、巰基乙酸鹽） 4 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)？ 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH 時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的 pH 稱(chēng)為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 5 蛋白質(zhì)沉淀包括哪兩大類(lèi)？這兩大類(lèi)各有什么特點(diǎn)？ （ 1） 可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤?pH 或 Pr 所帶電荷 ； Pr 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化 ； 適當(dāng)條件下可重新溶解 ； —— 非變性沉淀 ； pI 沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等 (2)不可逆沉淀：強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件 。破壞 Pr 膠體溶液穩(wěn)定性 。 也破壞 Pr 結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 。 沉淀不能再重新溶解 。—— 變性沉淀；加熱沉淀、強(qiáng)酸 /堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等 6 鹽析沉淀法的原理是什么？ 鹽析原理 :蛋白質(zhì)、酶在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加（此時(shí)稱(chēng)為鹽溶）；當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱(chēng)為 蛋白質(zhì)的鹽析。這一現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間電荷的極性基團(tuán)有著靜電引力，當(dāng)水中加入少量鹽類(lèi)時(shí)，由于鹽類(lèi)離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出。 7 什么是雙水相萃取法？常用的雙水相系統(tǒng)有哪些？ 雙水相萃取與水 有機(jī)相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時(shí)，物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等） 的 存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同。其分配情況服從分配定律，即，?在一定溫度一定壓強(qiáng)下，如果一個(gè)物質(zhì)溶解在兩個(gè)同時(shí)存在的互不相溶的液體里，達(dá)到平衡后，該物質(zhì)在兩相中濃度比等于常數(shù)?， 常用的雙水相系統(tǒng)有 :聚 乙 二醇 (PEG) + 磷酸鉀 (Kpi) 聚 乙二 醇 (PEG) + 葡聚糖 (DX ) 8 蛋白質(zhì)純化中層析的原理是什么？層析方法包括哪些種類(lèi)？ 層析原理：利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子的極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在 兩相中，其中一個(gè)相是固定的，稱(chēng)為固相，另一個(gè)相是流動(dòng)的，稱(chēng)為液相。待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 層析方法包括 吸附層析、分配層析、凝膠層析、親和層析、薄層層析、離子交換層析 9 親和層析的原理是什么？簡(jiǎn)單介紹其應(yīng)用 1）原理： 親和層析是利用抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原 （或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開(kāi)，達(dá)到分離提純的目的。親和層析技術(shù)具有高效、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。 2）應(yīng)用： 已廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類(lèi)等，也用于分離細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等。還應(yīng)用于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對(duì)此尚無(wú)互補(bǔ)配體的生物大分子；分離核酸等。親和層析因其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)在生物、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng) 用前景。 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可用此法分離純化膽固醇氧化酶 ,但是從實(shí)際操作和經(jīng)濟(jì)角度考慮，該法不適合大規(guī)模處理。 10 蛋白質(zhì)工程的定義？ 按人們意志改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能或創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)的過(guò)程。包括在體外改造已有的蛋白質(zhì)，化學(xué)合成新的蛋白質(zhì)，通過(guò)基因工程手段改造已有的或創(chuàng)建新的編碼蛋白質(zhì)的基因 ,合成新蛋白質(zhì)等。 11 蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容和基本目的是什么？ 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 —— 基礎(chǔ) ；結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè) —— 基礎(chǔ)的應(yīng)用與驗(yàn)證；創(chuàng)造和 /或改造蛋白質(zhì)（新蛋白質(zhì)） —— 終目標(biāo) 基礎(chǔ)研究包括蛋白質(zhì)合成機(jī)理、蛋白質(zhì)折疊機(jī)理 、蛋白質(zhì)序列語(yǔ)言的語(yǔ)法研究、生命起源與蛋白質(zhì)分子進(jìn)化、生物的壽命與蛋白質(zhì)代謝的研究。研究的核心內(nèi)容機(jī)構(gòu)功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、創(chuàng)造和改造 . 蛋白質(zhì)工程的目的改變蛋白質(zhì)的生物活性；改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；改變蛋白質(zhì)的特性；用于蛋白質(zhì)與功能研究 13 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)包括哪幾級(jí)結(jié)構(gòu)？試述各種結(jié)構(gòu)