【文章內(nèi)容簡介】 于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。 4 簡述動物細胞培養(yǎng)的一般步驟？大量培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法有哪些？ 培養(yǎng)動物細胞的一般步驟 : 取出目的細胞所在組織→ 洗凈 → 切成小組織塊 → 解離液中離散細胞 → 洗滌細胞 → 目的細胞移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 大量培養(yǎng)哺乳動物細胞的三種方法 : ①微導(dǎo)管培養(yǎng)法 由硝酸纖維素或醋酸纖維素制外徑小于 l mm 的多層微導(dǎo)管床浸沒于培養(yǎng)基中。管內(nèi)的無菌空氣經(jīng)擴散可進入營養(yǎng)液中，動物細胞貼附生長于微導(dǎo)管表面，細胞密度達 100 萬個 /cm2。 ②微載體培養(yǎng)法 以葡萄糖聚合物或其他聚合物制成與培養(yǎng)基比重基本相等的直徑從幾十微米到幾百微米的固體小珠 —— 微載體。 ③微膠囊培養(yǎng)法 將動物細胞與大約 4%的褐藻酸鈉混合后，滴到 CaCl2 溶液中，制成半透性微膠囊。 5 細胞融合常用的方法有哪些？各有什么優(yōu) 缺點？ 仙臺病毒誘導(dǎo)細胞融合經(jīng)四個階段： ①兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在 4℃條件下病毒附著在細胞膜上。并使兩細胞相互凝聚； ②在 37℃中，病毒與細胞膜發(fā)生反應(yīng)，細胞膜受到破環(huán)，此時需要 Ca2+和 Mg2+，最適 PH 為 一 ； ②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時需 Ca2+和 ATP； ④融合成巨大細胞，仍需 ATP 。 （ PEG）法 優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。 電融合法的優(yōu)點： 1)融合率高、重復(fù)性強、對細胞傷害??； 2）裝置精巧、方法 簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程； 3）免去 PEG 誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。 6 簡述胚胎移植的程序。 供體和受體的選擇 超數(shù)排卵處理 供體母畜的配種 胚胎的收集 胚胎的檢查 胚胎的保存與培養(yǎng) 供體和受體的術(shù)后觀察 7 簡述核移植操作的一般程序。 核移植克隆哺乳動物的技術(shù)操作過程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（ 寄母）等步驟 。 1．核受體細胞的準(zhǔn)備 去核卵母細胞常常作為核移植的受體細胞。這是因為在卵母細胞的細胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細胞重新回到發(fā)育過程的原點，同受精卵一樣開始個體發(fā)育過程。 卵母細胞的來源有兩種方式：一是用激素對雌體進行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的 MⅡ卵母細胞。二是從屠宰場收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘 — 卵母細胞復(fù)合體 (COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。 2．核供體細胞的準(zhǔn)備 在核移植操作中，細胞核供體細胞首 先必須是完整的二倍體，該細胞必須保持有供體動物完整的基因組；其次，供體細胞核必須能夠在受體細胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細胞分化過程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個正常動物個體的全過程。 供體細胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細胞。另外，核供體細胞的來源還有胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞。 3． 細胞核移植 常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。 即 通過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從 MII 期中解放出來，并轉(zhuǎn)到?受精?的狀態(tài)。 5．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng) 經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。 6．胚胎移植 重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。 8 核移植技術(shù)的應(yīng)用哪些領(lǐng)域？核移植技術(shù)意義和存在的問題？ 應(yīng)用： 1） 制備轉(zhuǎn)基因克隆動物， 進行生物藥物生產(chǎn)； 2） ．培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群 ； 3） 開展異種動物克隆，拯救瀕危動物； 4） 與干細胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆 5） 利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問題 。 重要生物學(xué)意義：第一，它證明了一個已經(jīng)完全分化了的動物體細胞仍然保持著當(dāng)初胚胎細胞的全部遺傳信息，并且經(jīng)此技術(shù)處理后，體細胞恢復(fù)了失去的全能性形成完整個體。 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳動物體細胞作為供體細胞繁殖的克隆羊，即成體母羊的復(fù)制品。它的成功提示我們可以進一步做到，在培育體細胞成為核供體之前，利用?基因靶?技術(shù)精確地誘發(fā)核基因的遺傳改變或精確地植入目的基因，再用選擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些產(chǎn)生了令人滿意變化的細胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。也就是 說，我們可以按照人的意志去改選、生產(chǎn)物種。 第三，在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中， 沒 有任何一項研究成果能夠比通過對基因進行有規(guī)律地控制而解決更多的問題的先例。多利羊的誕生及生長表明，利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳類動物的最后技術(shù)障礙已被突破，在理論上已成為可能。 克隆技術(shù)存在的問題 理論問題 ： a 分化的體細胞克隆對遺傳物質(zhì)重編（細胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細胞重新恢復(fù)全能性的過程）的機理還不清楚； b 克隆動物是否會記住供體細胞的年齡。 c 克隆動物的連續(xù)后代是否會累積突變基因。 d 在克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。 實踐問題 ： a 克隆動物的成功率還很低 b 生出的部分個體表現(xiàn)出生理或免疫缺限 ， 早衰跡象 9 利用已學(xué)的干細胞知識，論述干細胞在人類健康中的作用 （一）治療方面 ： 作為細胞治療與組織器官替代治療的種子細胞 ； 作為疾病基因治療的載體 （二）研究方面 ： 探討胚胎發(fā)育的調(diào)控機制 ； 利用胚胎干細胞體外整合外源基因，研究基因功能及與疾病的關(guān)系 ； 藥物篩選平臺的建立，藥理研究與新藥開發(fā) 干細胞治療研究及臨床應(yīng)用 ： 1）臨床前研究和臨床試驗： 神經(jīng)干細胞 : 中風(fēng) , MS, ALS, 腦癱 ,癡呆，記憶力喪失，腦外傷，脊髓損傷，失明 間充質(zhì)干細胞 : 腎臟、肝臟、胰腺和腦損傷，腸道疾病，骨關(guān)節(jié)病 肝 /胰腺干細胞 : I 型和 II 型糖尿病，肝炎和肝病，肝癌 造血干細胞：貧血，骨髓疾病，免疫系統(tǒng)疾病，慢性感染，狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 皮膚干細胞：燒傷，皮膚移植，皮膚疾病 肌肉干細胞：肌營養(yǎng)不良癥，心肌病，心臟病發(fā)作造成的損傷 肺細胞干細胞：肺氣腫，肺部疾病 2） 臨床應(yīng)用： 造血干細胞移植（白血病、淋巴瘤） 結(jié)合胚胎干細胞、成體干細胞、胰腺干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、骨髓造血干細胞、臍血干細胞、肝臟干細胞、干細胞與糖尿病治療、干細胞與心臟病治療、干 細胞與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、干細胞治療帕金森病、干細胞與脊髓損傷、干細胞與基因治療、腫瘤干細、急性髓性白血?。?AML)、腦腫瘤 、乳腺癌 、結(jié)腸癌 、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腦腫瘤回答（自由發(fā)揮） 10 腫瘤干細胞的起源有哪些？研究腫瘤干細胞有哪些意義？ 腫瘤干細胞（ CSCs)是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的細胞。腫瘤干細胞的起源 — 基因突變 、細胞融合。腫瘤干細胞的意義：針對預(yù)防和治療腫瘤干細胞的臨床干預(yù)措施 a 降低風(fēng)險：多酚，如異黃酮；b 早期檢測：檢測增值的干細胞及分泌的分子標(biāo)記物，如 EZH2； c 預(yù)防： 促進干細胞的凋亡雨分化，如維生素 D； d 治療：常規(guī)療法； e 靶向腫瘤干細胞的治療，如γ分泌酶抑制劑 11 什么是 iPS 細胞？簡述 iPS 細胞的應(yīng)用前景。 即 誘導(dǎo)性多潛能干細胞 ， 是將體細胞經(jīng)過基因改造轉(zhuǎn)化為具有多向分化潛能和自我更新能力的人造干細胞。 iPS 細胞的應(yīng)用前景 ： 核移殖技術(shù)、誘導(dǎo)性多潛能干細胞、腫瘤干細胞、干細胞與基因治療（參考）。利用iPS 細胞在疾病模型中進行細胞替代治療：鐮刀形細胞貧血癥、血友病 A、帕金森病、急性心肌梗死、糖尿病利用 iPS 細胞還原疾病的病理過程、提供體外疾病模型、以及建立特異性 iPS 細 胞系。 日本首次成功把人皮膚成纖維細胞改造成類似胚胎干細胞的多潛能干細胞 。 第四章 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)思考題 1 蛋白質(zhì)分離與純化包括哪幾個步驟？ 材料的選擇與預(yù)處理 確定有效成分含量測定方法 細胞的破碎 （機械破碎；溶脹和自溶；化學(xué)處理、生物酶降解） 提取 純化（包括鹽析、有機溶劑沉淀、有機溶劑萃取、吸附、層析、超速離心及結(jié)晶等） 濃縮、干燥及保存 2 確定樣品中蛋白質(zhì)有效成分的方法有哪些？ 分光光度計、熒光分析法、生物活性測定、電泳分析、化學(xué)分析法、免疫分析法 3 影 響蛋白質(zhì)抽提效果的因素有哪些？ 1） PH 值 2） 溶劑的極性和離子強度 3） 水解酶（加入抑制劑、調(diào)節(jié)抽提液 PH、離子濃度或極性） 4）溫度（ HCG、尿苷丙酮酸羧化酶） 5） 攪拌 6） 金屬離子（重蒸水、 EDTA、 5:1） 7） 氧化（ 2巰基乙醇、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、巰基乙酸鹽） 4 蛋白質(zhì)的等電點？ 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH 時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的 pH 稱為蛋白質(zhì)的等電點。 5 蛋白質(zhì)沉淀包括哪兩大類？這兩大類各有什么特點？ （ 1） 可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤?pH 或 Pr 所帶電荷 ； Pr 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化 ； 適當(dāng)條件下可重新溶解 ； —— 非變性沉淀 ； pI 沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等 (2)不可逆沉淀：強烈沉淀條件 。破壞 Pr 膠體溶液穩(wěn)定性 。 也破壞 Pr 結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 。 沉淀不能再重新溶解 ?！?變性沉淀；加熱沉淀、強酸 /堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等 6 鹽析沉淀法的原理是什么？ 鹽析原理 :蛋白質(zhì)、酶在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加（此時稱為鹽溶）；當(dāng)鹽濃度不斷上升時，蛋白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱為 蛋白質(zhì)的鹽析。這一現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間電荷的極性基團有著靜電引力，當(dāng)水中加入少量鹽類時，由于鹽類離子與水分子對蛋白質(zhì)分子上的極性基團的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出。 7 什么是雙水相萃取法？常用的雙水相系統(tǒng)有哪些？ 雙水相萃取與水 有機相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時，物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等） 的 存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同。其分配情況服從分配定律，即，?在一定溫度一定壓強下，如果一個物質(zhì)溶解在兩個同時存在的互不相溶的液體里，達到平衡后，該物質(zhì)在兩相中濃度比等于常數(shù)?， 常用的雙水相系統(tǒng)有 :聚 乙 二醇 (PEG) + 磷酸鉀 (Kpi) 聚 乙二 醇 (PEG) + 葡聚糖 (DX ) 8 蛋白質(zhì)純化中層析的原理是什么？層析方法包括哪些種類？ 層析原理：利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子的極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在 兩相中，其中一個相是固定的，稱為固相，另一個相是流動的，稱為液相。待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的 。 層析方法包括 吸附層析、分配層析、凝膠層析、親和層析、薄層層析、離子交換層析 9 親和層析的原理是什么？簡單介紹其應(yīng)用 1）原理： 親和層析是利用抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原 （或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達到分離提純的目的。親和層析技術(shù)具有高效、快速、簡便等優(yōu)點。 2）應(yīng)用： 已廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等，也用于分離細胞、細胞器、病毒等。還應(yīng)用于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補配體的生物大分子；分離核酸等。親和層析因其獨有的優(yōu)勢在生物、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng) 用前景。 實驗室內(nèi)可用此法分離純化膽固醇氧化酶 ,但是從實際操作和經(jīng)濟角度考慮，該法不適合大規(guī)模處理。 10 蛋白質(zhì)工程的定義？ 按人們意志改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能或創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)的過程。包括在體外改造已有的蛋白質(zhì)，化學(xué)合成新的蛋白質(zhì)，通過基因工程手段改造已有的或創(chuàng)建新的編碼蛋白質(zhì)的基因 ,合成新蛋白質(zhì)等。 11 蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容和基本目的是什么？ 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 —— 基礎(chǔ) ；結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計和預(yù)測 —— 基礎(chǔ)的應(yīng)用與驗證；創(chuàng)造和 /或改造蛋白質(zhì)（新蛋白質(zhì)） —— 終目標(biāo) 基礎(chǔ)研究包括蛋白質(zhì)合成機理、蛋白質(zhì)折疊機理 、蛋白質(zhì)序列語言的語法研究、生命起源與蛋白質(zhì)分子進化、生物的壽命與蛋白質(zhì)代謝的研究。研究的核心內(nèi)容機構(gòu)功能的設(shè)計和預(yù)測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、創(chuàng)造和改造 . 蛋白質(zhì)工程的目的改變蛋白質(zhì)的生物活性；改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；改變蛋白質(zhì)的特性；用于蛋白質(zhì)與功能研究 13 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)包括哪幾級結(jié)構(gòu)？試述各種結(jié)構(gòu)