【文章內(nèi)容簡介】 測基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類,在蛋白質(zhì)類雜質(zhì)中,、熱源質(zhì)內(nèi)毒素、,一般認為沒劑量DNA含量不超過100pg是安全的,殘余的DNA含量較多時可采用核酸雜交法檢測.(3)生物活性測定生物活性測定是保證基因工程產(chǎn)品有效性的重要手段,往往需要進行動物體內(nèi)實驗和通過細胞培養(yǎng)進行細胞體外效價測定.(4)安全性評價除了要保證無病毒、無菌、無熱源質(zhì)、無致敏原等一般安全性的要求外,還需要根據(jù)基因工程產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)特性,但在氨基酸序列和翻譯后修飾上存在差異,這就要求對其進行至突變、致癌和至畸等遺傳病理性質(zhì)的考察.(5)穩(wěn)定性考察產(chǎn)品穩(wěn)定性是評價生物制品有效性和安全性的重要指標之一也是確定制品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù).(6)產(chǎn)品一致性的保證基因工程制藥是一個十分復雜的過程,不但要強調(diào)對最終產(chǎn)品的綜合性檢定,、血清及添加劑來源與質(zhì)量等都是應(yīng)該給予特別關(guān)注的檢測問題.:(1)磨切法:是機械破碎方法,設(shè)備有組織搗碎機,膠體磨、勻漿器、勻質(zhì)機,珠磨機,乳缽等(2)壓力法:滲透壓法、高壓法與減壓法,使氣體融入細胞,它是使細胞在濃鹽中平衡,再投入水中,水迅速進入細胞內(nèi),引起細胞膨脹破裂.(3)反復凍融法:將細胞放在低溫下冷凍,然后在室溫中融化,如此反復,:一方面,在冷凍過程中是細胞膜的疏水健結(jié)構(gòu)斷裂,從而增加細胞親水性。另一方面,冷凍是細胞內(nèi)的水結(jié)晶,形成冰晶粒,使細胞膨脹破碎.(4)超聲振蕩破碎法:當聲波達到20000C/s時,可使液體產(chǎn)生非?？焖俚恼饎?在液體中產(chǎn)生空穴效應(yīng)而使細胞破碎.(5)酶溶碎法:利用沒反應(yīng)分解細胞壁上的特殊結(jié)構(gòu)連鍵,破壞細胞壁結(jié)構(gòu)而達到破碎細胞的目的.,自從1950年衛(wèi)生部批準成立國家生物制品檢定所以來,其中的一項重要任務(wù)就是抓生物制品的國家標準起草、修訂和落實執(zhí)行,向衛(wèi)生部和國家食品藥品監(jiān)督管理局寫報告,成立衛(wèi)生部生物制品委員會、衛(wèi)生部生物標準化委員會、中國生物制品標準化委員會、主持在不同時期負責中國《生物制品法規(guī)》和《中國生物制品規(guī)程》《生物制品法規(guī)》和《中國生物制品規(guī)程》中的各種制品規(guī)程,、生產(chǎn)、質(zhì)量鑒定、,除符合生產(chǎn)所在的國家標準外,還必須符合我國生物制品現(xiàn)行國家標準.:(1)它是利用活的細胞作為表達系統(tǒng)來制備產(chǎn)品,因此,所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往分子量較大,并具有復雜的分子結(jié)構(gòu).(2)許多基因工程生物制品都是參與人體一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必須的蛋白質(zhì),都可能貽誤病情甚至造成嚴重的危害.(3)宿主細胞中表達的外源基因,在轉(zhuǎn)錄或翻譯、工藝放大等過程中都有可能發(fā)生變化.(4)分泌量極低而生理、,但引起的生物學反應(yīng)卻有逐步放大的作用,故作為生物制品的使用劑量非常低.(5),它們引起的反應(yīng)都是通過與受體結(jié)合,以形成的受體．配體復合物而開始的,因此,生長因子只對其相應(yīng)的受體細胞才有活性.(6)要求進行理化鑒定,包括產(chǎn)品的特性、純度及與天然產(chǎn)品的一致性,如N端15個氨基酸序列、肽圖、聚丙烯酰胺凝膠電泳與等電聚焦電泳、高效液相色譜等分析.(7)要求進行外源核酸合抗原檢測,規(guī)定每劑量DNA含量不超過100pg,包括色譜柱試劑和親和色譜用的鼠IgG等.(8)生物活性或效力實驗結(jié)果應(yīng)與天然產(chǎn)品進行比較.:技術(shù)條件要溫和,要抑制宿主細胞或分泌產(chǎn)物中相應(yīng)的酶活性,防止其消化降解待提純產(chǎn)物,以保持目的產(chǎn)物的生物活性。選擇性要好,優(yōu)化選擇與組合各種分離純化技術(shù)方法以達到較高純化倍數(shù)。去除細胞或分泌產(chǎn)物中非目標產(chǎn)物成分,同時盡量保持較高目標產(chǎn)物成分的回收率。要能直接銜接,不需要對物料加以處理或調(diào)整。整個分離純化過程要快,時間短,能夠滿足高生產(chǎn)率要求。保持環(huán)境清潔,防止雜物污染.:％乙醇為提取溶劑,也可用82％乙醇,拌加碳酸鈣,以50％乙醇溫浸,浸液合并,于4045度減壓濃縮至適當體積,再用中性醋酸去不溶物如無機鹽或殘留的蛋白質(zhì)等,醇液經(jīng)活性炭脫色、濃縮、冷卻、滴加乙醚,或置于硫酸感知器中旋轉(zhuǎn),單糖或小分子寡糖也可以在提取后,用吸附色譜法或離子交換法進行一步純化.:產(chǎn)物大多數(shù)處于細胞內(nèi),故提取前需將細胞破碎,增加了很多困難。產(chǎn)物濃度較低、雜質(zhì)多,而最后產(chǎn)品需要達到的高純度,所以提取較困難,且收率低,常需要好幾步操作,并需要高分辨率的精制方法。產(chǎn)物多是大分子蛋白質(zhì)．通常不穩(wěn)定,遇熱、極端pH、有機溶劑和剪切力等引起失活.:分離效率高,是所有分離純化技術(shù)中最高的。選擇性強可變參數(shù)多,以適應(yīng)各種不同樣品的分離要求。過程自動化操作。分離快速,高效液相色譜分離技術(shù)的采用,保證可在高分離效率的前提下可提高單位的產(chǎn)量。使用范圍廣。高靈敏度的在線檢測.:有效成分含量高,新鮮。原料來源豐富,產(chǎn)地接近。其中雜質(zhì)含量可能減少,對由起始原料引入雜質(zhì)、異構(gòu)體,必要時應(yīng)進行相關(guān)的研究并提供質(zhì)量控制方法。原料成本要低。,富含所需目的物并易于獲得。原材料還應(yīng)有來源、標準和供貨商的檢驗報告,必要時應(yīng)根據(jù)制備工藝的要求建立內(nèi)控標準。對具有手性的起始原料,應(yīng)定制作為對雜質(zhì)對映體異構(gòu)或非對映異構(gòu)體的限度,同時應(yīng)對該起始原料在制備過程中可能引如雜質(zhì)有一定了解.:基于分子篩的排阻效應(yīng),選用不同大小的凝膠,小分子物質(zhì)可進入孔徑,緩慢移動,而大分子物質(zhì)則不能進入孔徑,分辨力強不會引起蛋白質(zhì)變性,但將引起樣品溶液的大量稀釋,此外還可用于除鹽.(DNA)和核糖核酸(RNA),RNA主要存在于細胞質(zhì)中,．脫氧核糖,嘌呤堿有腺嘌呤、鳥嘌呤等,嘧啶堿有胞嘧啶、．,之后再與磷酸結(jié)合形成核苷酸,而不同的核苷酸又連接形成了DNA或RNA.、提取核蛋白,使其與其他細胞成分分離。然后,用蛋白質(zhì)變性劑如苯酚、去垢劑,或蛋白酶處理去除蛋白質(zhì)。這種提取與去蛋白工程要重復幾次,最后所獲得的核酸溶液,再用乙醇等使其沉淀、另外,核酸純化的原理是根據(jù)分子大小,(MAK),因為單鏈DNA比雙鏈結(jié)合更牢固?；蛘哂昧u基磷灰石柱,:以包含體形式存在的蛋白質(zhì)不具有正確的天然三維結(jié)構(gòu),表達蛋白不具有生物活性,也為重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)提供了幾點優(yōu)勢:包含體具有高密度,并且在水溶液中通常不容解,通過簡單的離心就可以分離得到,可以容易地與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離,有利于表達產(chǎn)物的分離純化。重組融合蛋白以包含體的形式表達有效地抵御了大腸桿菌中蛋白酶對表達蛋白的降解。對于生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)想時對宿主細胞有害的蛋白,包含體的形成無疑是最佳的選擇,:細菌收集與破碎,包含體的分離、洗滌與溶解,變性蛋白質(zhì)的純化,重組蛋白質(zhì)的復性,天然蛋白質(zhì)的分離等. :在工程菌菌種貯存中要求種子克隆純而穩(wěn)定。在培養(yǎng)工程中,要求工程菌所含有的質(zhì)粒穩(wěn)定,始終無突變。在重復生產(chǎn)發(fā)酵中,工程菌表達穩(wěn)定。,無細菌、病毒、真菌和支原體等污染,詳細敘述種子來源,方式、保存及預計使用期,保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性.,確證提純物分子批問保持一致性。外源蛋白質(zhì)、,包括能夠去除宿主細胞蛋白、核酸、糖、病毒或者其他雜質(zhì),可依據(jù)生物制品的用途和用法而確定,如僅使用一次或需要的反復多次使用等。另外,用于重癥患者的生物制品,對純度的要求可能也是千差萬別.:低溫保存,液體蛋白質(zhì)樣品在2010度以下冰凍保存比較理想。超低溫保存,通常采用的方法是液氮超低溫保藏。在穩(wěn)定的pH條件下保存。高濃度保存。加保護劑保存.第四章 :再I臨床輸血的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它通過將血漿中的有效組分分離出來并用于治療,較好地解決了全血不易運輸和大量長期儲存中的問題. :專指用物理的和機械的方法分離出來的血液的一部分,如各種血細胞、血漿等,屬于“單供者制品”,即從單個和血型相同的供者血液中采集的.:新鮮采集的抗凝全血在4℃條件下離心后分離出的血漿.:又稱冷凍血漿,與新鮮冷凍血漿的區(qū)別是來源不同. :冷沉淀又稱冷沉淀抗血友病因子.:指在3037℃中融化后的新鮮冷凍血漿,因故未輸注而在16℃保存,且保存期在5天以內(nèi).:指全血采集后24h內(nèi)分離血漿,并用．30℃冰箱或速凍冰箱冷凍成塊.:是指從人血漿中分離制備制備的有明確臨床療效和應(yīng)用意義的蛋白制品的總稱,:以前稱丙種球蛋白,現(xiàn)在稱為正常人免疫球蛋白,是由乙型肝炎疫苗免疫健康人得血漿或血清,經(jīng)低溫乙醇法提取得免疫球蛋白制劑,有液體和凍干兩種劑型,僅供肌內(nèi)注射.:通過對獻血者血漿的檢測篩選,或給志愿獻血者注射各種疫苗進行超免疫,獲得針對某種抗原具有高效價抗體的血漿,因此稱為特異性免疫球蛋白. :是由一系列蛋白質(zhì)分子組成的,是機體的主要防御體系之一,在許多生物學反應(yīng)種,如吞噬、調(diào)理、趨化和細胞融解等,都有著重要作用. :是指利用各種組分與固定相親和力或相互作用方面的差異,實現(xiàn)各種組分的分離.:是一種有形的物質(zhì),它來源于人體的血液,經(jīng)腎臟細胞的循環(huán)與過濾作為排排出提體外,其成分包括許多人體未吸收的物質(zhì)與人體的代謝產(chǎn)物,其中的許多成分是具體有生物活性的物質(zhì),對許多疾病有治療作用,對人體有保健功能.(IL):細胞因子中由白細胞或其他體細胞產(chǎn)生且在自細胞問起調(diào)節(jié)和介導作用的因子.:l、效價高、療效可靠安全性好、不易產(chǎn)生副反應(yīng)穩(wěn)定性好資源有限、研究意義重大:血液制品、尿液制品、胎盤制品、人體液細胞中的活性物質(zhì).、血液成分制品、血漿蛋白制品.、白細胞制劑、血小板制劑和血漿制劑.、可經(jīng)血液制品傳播的病毒血液制品病毒滅活／去除方法,主要成分有尿素、氯化鈉、鉀、磷酸、硫酸、尿酸、肌酐、氨、馬尿酸及微量的酚、草酸、尿籃母、鈣、鎂、維生素B維生素B維生素B維生素C、葉酸、尿激酶及多種激素.,從健康男性尿液中可制備尿激酶、激態(tài)釋放酶、尿抑胃素、蛋白酶抑制劑、睡眠因子、集落刺激因子(CSF)從妊夠婦女與絕經(jīng)婦女尿液中可制備人絨毛膜促性腺激素.、激素、調(diào)節(jié)肽、生長因子、細胞因子等生物活性物質(zhì).,一種是從健康人血漿中分離制得得人血清白蛋白,另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤中分離制得得胎盤白蛋白.四．重點及難點 :(1)全血:全血輸注主要適用用于同時需要補充紅細胞和血容量的患者,如各種原因引起的失血量超過全身總量的40％、血小板裂解后的殘留物,因此不適用于血容量正常的貧血、,全血傳播肝炎、梅毒、艾滋病、,“一血多用”,使寶貴的血液資源得到充分合理的利用.(2)血液成分制品 、添加液紅細胞、洗滌紅細胞、去白細胞紅細胞、冰凍紅細胞、代血漿紅細胞懸液、照射紅細胞、年輕紅細胞、,發(fā)揮其細胞吞噬作用和殺菌能力,、,對血小板缺乏性出血有糾正作用,、,使輸入的血小板遭到破壞,還會引起短期的粒細胞減少.:新鮮冷凍血漿、普通冷凍血漿、,并可能在許多l(xiāng)臨床疾病中應(yīng)用,包括先天性或獲得性凝血因子缺乏癥、,該制品含有全部穩(wěn)定地凝血因子,但缺乏不穩(wěn)定地凝血因子V和凝血因子Ⅷ.臨床上用于擴充血容量,(4177。2)℃條件下經(jīng)離心后分出血漿,.(3),:調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓,、失血性休克、,以增強機體的體液免疫,、. 蛋白酶抑制劑類制品α1抗胰蛋白酶含量高,能保護機體正常細胞不受蛋白酶的破壞和損傷,能協(xié)助控制感染和炎癥,、抗凝血酶Ⅲ、血漿運載蛋白類制品能在血液循環(huán)中對機體的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、激素、藥物等進行轉(zhuǎn)輸?shù)难獫{蛋白.(4)血液制品的安全性:血液制品病毒滅活/去除方法有加熱、有機溶劑/表面活性劑、β丙內(nèi)脂法、過濾、低pH法、美藍/熒光照射法、色譜.:(1)尿激酶(UK)也稱尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA),是一種在人腎臟中合成并由人尿釋放的絲氨酸水解酶,尿激酶原(proUK)(HUK)和低分子尿激酶(LUK) ,血纖維蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白質(zhì)底物,在生物體內(nèi),UK通過特異性地裂解纖溶酶原地肽鍵,將纖溶酶原活化為有活性地纖溶酶,從而產(chǎn)生溶栓效應(yīng).(2)激肽釋放酶又稱尿激酶,是從人尿中提取的一種絲氨酸蛋白酶,可以擴張毛細血管、松弛血管平滑肌、改善微循環(huán)、增加學流量、抗凝、溶血栓、降低血液黏度、降血壓、治療男性不育等(3)尿抑胃素主要作用是抑制胃酸分泌.(4)人尿胰蛋白酶抑制劑臨床上主要用于治療急性胰腺炎、減少心臟外科術(shù)后出血、防治腦血管疾病、抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移.(5)人絨毛膜促性腺激素臨床上主要用于女性不孕癥、治療習慣性流產(chǎn)、黃體功能不全,對神經(jīng)性皮炎也有效,也可用于男性垂體功能分泌不足所致的性功能低下癥.:胎盤能產(chǎn)生多種蛋白、激素、調(diào)節(jié)肽、生長因子、細胞因子等生物活性物質(zhì),它們在胎盤內(nèi)部產(chǎn)生極其復雜的相互調(diào)控作用,以維持胎盤的生長發(fā)育,并進入血循環(huán),對胎兒的生長發(fā)育及母體的內(nèi)分泌功能都起到重要的調(diào)劑作用.(1)人胎盤血白蛋白主要用于治療因失血、創(chuàng)傷及燒傷等引起的休克,腦水腫及大腦損傷所致的腦壓增高,防治低蛋白血癥以及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水,有較好的療效. (2)人絨毛膜促性腺激素刺激性腺活動和維持早期妊娠和早期胚胎發(fā)育的功能,還能產(chǎn)生免疫抑制作用,是妊娠母體免疫應(yīng)答能力下降,抑制母體對胎兒的排斥,并具有甲狀腺刺激活性.(3)促性腺刺激釋放激素可治療特發(fā)性低促性腺激素性功能減退癥、不育癥以及由缺乏促性腺刺激釋放激素所致的閉經(jīng)、不排卵和多囊卵巢綜合癥等疾病.(4)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素對于妊娠后母體或胎兒的應(yīng)激功能和分娩過程的始動起到重要作用.(5)人胎盤免疫調(diào)節(jié)因子活性成分主要是小分子多肽,人胎盤免疫調(diào)節(jié)因子具有多種生物活性,能提高機體的免疫功能,具有良好的免疫調(diào)節(jié)、增強作用及抗突變作用,對病毒性疾病、免疫缺陷疾病及惡性腫瘤等多種疾病均有較好的臨床效果.(6)胎盤RNA酶抑制劑此類蛋白在體內(nèi)的功能是作為胰RNA酶超家族、. :(1)人血漿白蛋白制劑的制備:生產(chǎn)白蛋白的主要方法有鹽析法、低溫乙醇法、. a、低溫乙醇法是以混合血漿為原料,逐級降低酸度,同時降低溫度,各種蛋白在不同的條件以組分的形式分別從溶液中析出,:①操作比較簡單,產(chǎn)量高,適合自動化、工業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn).②對蛋白脂活性影響小,能基本保持分離所得的蛋白質(zhì)的天然性質(zhì).③低溫、乙醇分離過程能抑制細菌生長、去除病毒、控制熱源,較有效地保證了制品的安全性.④可分離多種血漿蛋白成分,有利于血漿資源的綜合利用.⑤乙醇作為主要的生產(chǎn)資源,價格低廉,易獲得. b、低溫乙醇法得到的各種組分均為粗制品,需要進一步超濾、色譜、除菌、病毒滅活、色譜法是一種常用的蛋白分析和分離的方法,主要用來對低溫乙醇法產(chǎn)生的一些粗制品進行加工精致,、白蛋白的