【文章內(nèi)容簡介】 （亞甲藍）實際上是氯化亞甲藍鹽（methylene blue chloride,縮寫為MBC），它可被電離成正、負離子：MBC methylene blue+﹢chloride帶正電荷的染料離子可使細菌細胞染成藍色。常用的堿性染料除美藍外，還有結(jié)晶紫（crystal violet）、堿性復(fù)紅（basic fuchsin）、番紅（又稱沙黃，safranine）等。細菌體積小，較透明，如未經(jīng)染色常不易識別，而經(jīng)著色后，與背景形成鮮明的對比，易于在顯微鏡下進行觀察。三、器材顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，玻璃鉛筆，吸水紙，試管架，火柴，小燒杯，酒精瓶等；　呂氏堿性染色液，石炭酸復(fù)紅染色液；金黃色葡萄球菌菌種，枯草芽孢桿菌菌種。四、操作步驟1．涂片 取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，嚴(yán)格按無菌操作程序（圖1），分別挑取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌于二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調(diào)勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時不宜過多，涂片必須均勻，挑取菌種時切勿將培養(yǎng)基挑破。 圖1 無菌操作及制片過程2．干燥 于室溫中自然干燥。3．固定 涂片面向上，于火焰上通過2—3次，使細胞質(zhì)凝固，以固定細菌的形態(tài)，并使其不易脫落。但不能在火焰上烤，否則細菌菌體變形。4．染色 放標(biāo)本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色時間長短隨不同染色液而定。呂氏堿性美藍染色液約染2—3分鐘，石炭酸復(fù)紅染色液約染1—2分鐘。5．水洗 染色時間到后，用自來水沖洗，直至沖下之水無色時為止。注意沖洗水流不宜過急，過大，水由玻片上端流下，避免直接沖在涂片處。沖洗后，將標(biāo)本晾干或用吹風(fēng)機吹干，待完全干燥后才可置油鏡下觀察。6．顯微鏡觀察利用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察細菌的個體形態(tài)。五、實驗報告1．繪出你所觀察到的經(jīng)單染色的兩種細菌形態(tài)圖。2．根據(jù)實驗體會，你認為制備染色標(biāo)本時，應(yīng)注意哪些事項？2．制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？實驗八細菌的革蘭氏染色法一、目的要求1．了解細菌革蘭氏染色的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的制片技術(shù)。2．觀察細菌的各種形態(tài)結(jié)構(gòu)。3．鞏固課堂知識，增強感性認識。二、基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料(basic dye)初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和復(fù)染液（counterstain）。堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫（crystal violet）。媒染劑的增加染料和細胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落，碘（iodine）是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細胞進行脫色，不同類型的細胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95%的酒精（ethanol）。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區(qū)分成G+和G兩大類群。三、器材大腸桿菌菌種（1號菌種），枯草芽孢桿菌菌種（2號菌種）；革蘭氏染色的四種染液，載玻片，顯微鏡，接種環(huán)，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水或無菌水，玻璃鉛筆，吸水紙，火柴，小燒杯，酒精瓶，酒精燈，試管架，攝子等。四、操作步驟1．涂片前在載玻片上做標(biāo)記。2．涂片　本實驗采用“三區(qū)”涂片法。在載玻片的左右兩端，各加1滴水，嚴(yán)格按無菌操作程序，用無菌接種環(huán)挑取少量1號菌種與左邊水滴充分混合成僅有1號菌的區(qū)域，并將少量菌液由左向右延伸至玻片的中央，把接種環(huán)上殘留的菌燒掉。再用無菌的接種環(huán)挑取少量2號菌種與右邊水滴充分混合成僅有2號菌的區(qū)域，并將少量菌液由右向左延伸至玻片的中央，使1號菌和2號菌在玻片的中央混合成含有兩種菌的混合區(qū)。3．干燥和固定　涂片自然干燥后，手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通過3—4次（用手指觸涂片反面，以不燙手為宜），待冷卻后再加染液。（注意涂片不可過于濃厚）4．染色（1）初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。（2）媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。（3）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。（4）復(fù)染 用番紅液染1—2分鐘，水洗。（5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細菌，常常呈假陽性。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。五、實驗報告1．在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌？圖示菌體形態(tài)。2．作革蘭氏染色涂片時為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？3．當(dāng)你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實驗九 顯微鏡直接計數(shù)法一、目的要求1．明確顯微鏡計數(shù)的原理。2．學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。二、基本原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（㎜3），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。血球計數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室，微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進行。（圖2） 圖2 血球計數(shù)板的結(jié)構(gòu)圖 計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，共400小格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格，總共也是400小格。所以無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的。每一個大方格邊長為1㎜，則每一大方格的面積為1㎜2，蓋上蓋玻片后，㎜，㎜3。其計算方法如下：1．1625的計數(shù)板計算公式細胞數(shù) ml=(100小格內(nèi)的細胞數(shù) 100)4001000稀釋倍數(shù)2．2516的計數(shù)板計算公式細胞數(shù) ml=(80小格內(nèi)的細胞數(shù) 80)4001000稀釋倍數(shù)三、器材酵母菌懸液，血球計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細管等。四、操作步驟1．稀釋將酵母菌懸液進行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2．鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數(shù)。3．加樣品將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），使菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置5—10分鐘即可計數(shù)。4．顯微鏡計數(shù)將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個菌體為宜。若選用2516規(guī)格的計數(shù)板則每個計數(shù)室選5個中方格，可選4個角和中央的中格（即80個小格），若選用1625規(guī)格的計數(shù)板，則數(shù)四個角：左上、右上、左下、右下的四個中方格，（即100小格）中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。5．清洗血球計數(shù)板使用完畢后，將血球計數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其化沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。五、實驗報告1．將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。 各中格中菌數(shù)AB菌數(shù)/ml二室平均值12345第一室第二室2．為什么用兩種不同規(guī)格的計數(shù)板測同一樣品時，其結(jié)果一樣？實驗十　微生物大小的測量一、目的要求掌握用顯微測微尺測量微生物大小的基本方法。二、基本原理微生物細胞大小，是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下測量。用來測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺（圖3）和鏡臺測微尺（圖4）。鏡臺測微尺（圖4）是中央部分刻有精確等分線的載玻片。一般將1㎜等分為100格（2㎜等分為200格），㎜（即10μm）。是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。圖3 目鏡測微尺A．　目鏡測微尺；A． 旋開接目鏡透鏡，放入目鏡測微尺；B． 將接目鏡插回鏡筒目鏡測微尺（圖3，A）是一塊可放在接目鏡內(nèi)的隔板上的圓形小玻片，其中央刻有精確的刻度，有等分50小格或100小格兩種，每5小格間有一長線相隔。由于所用接目鏡放大倍數(shù)和接物鏡放大倍數(shù)的不同，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也就不同，因此，目鏡測微尺不能直接用來測量微生物的大小，在使用前必須用鏡臺測微尺進行校正，以求得在一定放大倍數(shù)的接目鏡和接物鏡下該目鏡測微尺每小格的相對值，然后才可用來測量微生物的大小。三、器材枯草芽孢桿菌染色玻片標(biāo)本，目鏡測微尺，鏡臺測微尺，顯微鏡，擦鏡紙，香柏油二甲苯等。四、操作步驟1．目鏡測微尺的標(biāo)定（1）放置目鏡測微尺 取出接目鏡，旋開接目鏡透鏡，將目鏡測微尺的刻度朝下放在接目鏡筒內(nèi)的隔板上（圖3，B），然后旋上接目透鏡，最后將此接目鏡插入鏡筒內(nèi)（圖3，C）。圖4 目測微尺和鏡臺測微尺①目鏡測微尺②鏡臺測微尺③鏡臺測微尺的中心部放大④鏡臺測微尺標(biāo)實目鏡測微尺時兩者重疊 （2）放置鏡臺測微尺 將鏡臺測微尺置于顯微鏡的載物臺上，使刻度面朝上。（3）校正目鏡測微尺 先用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，當(dāng)看清鏡臺測微尺后，轉(zhuǎn)動接目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使目鏡測微尺和鏡臺測微尺的某一區(qū)間的兩對刻度線完全重合，然后計數(shù)出兩對重合線之間各自所占的格數(shù)。例如實驗圖4④中A(目鏡測微尺)上5格對準(zhǔn)B鏡臺測微尺上的2格，B的1格為10μm,2格的長度為20μm,所以目鏡測微尺上1小格的長度為4μm 。根據(jù)計數(shù)得到的目鏡測微尺和鏡臺測微尺重合線之間各自所占的格數(shù)，通過如下公式換算出目鏡測微尺每小格所代表的實際長度。兩對重合線間鏡臺測微尺格數(shù)10兩對重合線間目鏡測微尺格數(shù)目鏡測微尺每小格長度（μm）=2105=4μm 同法校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。2．菌體大小的測定目鏡測微尺校正后，移去鏡臺測微尺，換上枯草芽孢桿菌染色玻片標(biāo)本，校正焦距使菌體清晰，轉(zhuǎn)動目鏡測微尺（或轉(zhuǎn)動染色標(biāo)本），測出枯草芽孢桿菌的長和寬各占幾小格，將測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺每小格所代表的長度，即可換算出此單個菌體的大小值，在同一涂片上需測定10至20個菌體，求出其平均值，才能代表該菌的大小。3．取出目鏡測微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦試后，放回盒內(nèi)保存。五、實驗報告1．將目鏡測微尺校正結(jié)果填入下表。接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度（μm）低倍鏡高倍鏡油 鏡接目鏡倍數(shù)_______________________2．在高倍鏡和油鏡下測量枯草芽孢桿菌大小，將結(jié)果填入下表。菌 體編 號長（μm）寬（μm）菌體大?。ㄆ骄担╅L寬（μm）目鏡測微尺格數(shù)菌體長度目鏡測微尺格數(shù)菌體寬度123456789103．當(dāng)接目鏡不變，目鏡測微尺也不變，只改變接物鏡，目鏡測微尺每格所量的鏡臺上物體的實際長度是否相同？為什么？ 第二部分　綜合性實驗和設(shè)計性實驗實驗十一　微生物培養(yǎng)基的制備一、目的要求1．明確培養(yǎng)基的配制原理2．通過對微生物培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二、基本原理培養(yǎng)基是人工地將多