【正文】 （2。在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml水樣。三、器材圖5 多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的操作步驟和結(jié)果解釋乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍(lán)或復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂平板，滅菌水；載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管，革蘭氏染液，顯微鏡，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，滅菌三角瓶等。3．復(fù)發(fā)酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過此試驗再進一步證實。48小時后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。乳糖能起選擇作用，因為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。多管發(fā)酵法包括初發(fā)酵試驗、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗三個部分。大腸菌群是一群以大腸埃希氏菌（Escherichia　coli）為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在37℃生長時，能在48小時內(nèi)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。2．了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30—300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30—300之間的，當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。若其中一個培養(yǎng)皿有較大片狀菌苔生長時，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無片狀菌苔生長的培養(yǎng)皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。(d)凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(b)自最后三個稀釋度的試管中各取1ml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做三個培養(yǎng)皿。稀釋倍數(shù)看水樣污濁程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30—300個之間的稀釋度最為合適，若三個稀釋度的菌數(shù)均多到無法計數(shù)或少到無法計數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。（2）池水、河水或湖水等(a)稀釋水樣 取3個滅菌空試管，分別加入9ml滅菌水。(d)培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃溫箱中，培養(yǎng)24小時，進行菌落計數(shù)。(b)分別傾注約15ml已溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立 即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。2．細(xì)菌總數(shù)測定（1）自來水(a)用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。（1）自來水 先將自來水龍頭用火焰燒灼3分鐘滅菌，再開放水龍頭使水流5分鐘后，用滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。為了要正確反映水質(zhì)在采樣時的真實情況，水樣在采取后應(yīng)立即送檢，一般從取樣到檢驗不應(yīng)超過4小時。三、器材肉膏蛋白胨脂培養(yǎng)基，滅菌水，冰箱，滅菌三角燒瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管，滅菌試管等。在水質(zhì)衛(wèi)生學(xué)檢驗中，細(xì)菌總數(shù)是指1ml水樣在肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，置37℃經(jīng)24小時培養(yǎng)后，所生長的細(xì)菌菌落的總數(shù)。二、基本原理本實驗采用平板計數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)。2．每一類群菌落總數(shù)是多少？3．在平板劃線（a）中，為什么每次都需將接種環(huán)上的剩余物燒掉?實驗十七 水中細(xì)菌總數(shù)的測定一、目的要求1．學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測定的方法。（3）挑菌 同稀釋涂布平板法，直到獲得純培養(yǎng)。(b)將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。3．平板劃線分離法（1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。（5）挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。（3）涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上10105和106三種稀釋度，然后用三支1ml無菌吸管分別由10，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。最好是將平板放室溫2—3天，或37℃培養(yǎng)24小時，檢查無菌落及皿蓋無冷凝水后再使用。四、操作步驟1．稀釋涂布平板法（1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至55—60℃時，然后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則瓶塞不必夾在手指中。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化微生物，直至得到純菌株。實驗十六 土壤中微生物的檢測技術(shù)一、目的要求1．掌握倒培養(yǎng)基平板的方法　　2．學(xué)習(xí)分離純化微生物的基本操作技術(shù)。N100100πｒ2X=X：每m3空氣中的細(xì)菌數(shù)N：平板暴露5分鐘，置37℃培養(yǎng)24小時后生長的菌落數(shù)r：平皿底半徑（㎝）五、實驗報告 菌落平均數(shù)環(huán)境細(xì)菌霉菌放線菌室外5min10min室內(nèi)5min10min2．用沉降法計算1m3空氣環(huán)境中所含菌數(shù)。（4）蓋上皿蓋，將平板倒置，置于28℃溫箱中，細(xì)菌培養(yǎng)48小時，霉菌與放線菌培養(yǎng)時間分別為4—6天，計算其菌落數(shù)，觀察菌落形態(tài)、顏色等。另四個培養(yǎng)皿，在實驗室空氣中分別暴露5分鐘、10分鐘（一般不同時間各平行三皿）。（2）將上述三種培養(yǎng)皿各取四個。通過培養(yǎng)基平板檢查空氣環(huán)境中微生物數(shù)量和類型，可用于測定空氣質(zhì)量和污染指數(shù)的評定?？諝庵械奈⑸镒匀怀两涤谂囵B(yǎng)基的表面，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)其上生長的菌落數(shù)，按公式計算1m3空氣中的微生物總數(shù)。3．各類微生物的數(shù)量是多少？實驗十五 空氣中微生物的檢測技術(shù)一、目的要求1．學(xué)習(xí)空氣中微生物的檢測技術(shù)2．體會無菌操作的重要性二、基本原理被微生物污染的空氣是呼吸道傳染病的主要傳播途徑。四、菌落形態(tài)特征的觀察由于微生物個體表面結(jié)構(gòu)、分裂方式、運動能力、生理特性及產(chǎn)生色素的能力等各不相同，個體及它們的群體在固體培養(yǎng)基上生長狀況各不一樣，按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落特征，可粗略辨別是何種類型的微生物，應(yīng)注意菌落的形狀、大小、表面結(jié)構(gòu)、邊緣結(jié)構(gòu)、菌叢高度、顏色、透明度、氣味、粘滯性、質(zhì)地軟硬情況、表面光滑與粗糙情況等。菌落特征的觀察也是檢查菌種純度，辨認(rèn)和鑒定菌種的重要依據(jù)。2．通過觀察和比較各類微生物的菌落特征，達(dá)到初步鑒別微生物類群的能力。樣品來源菌落數(shù)（近似值）菌落類型特征描寫大小形態(tài)干濕高度透明度顏色邊緣1.123452.123452．與其他同學(xué)所做的實驗結(jié)果進行比較。 (g)邊緣 整齊、不整齊。(e)高度 扁平、隆起、凹下。(c)干濕情況 干燥、濕潤、粘稠。可先將整個平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個大小范圍。但要注意，如果細(xì)菌數(shù)量太多，會使很多菌落生長在一起，或者限制了菌落生長而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點時，要選擇分離得很開的單個菌落。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。4．將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1—2天。（4）牙垢用滅菌牙簽取牙垢按種在瓊脂平板表面，然后蓋上皿蓋。（2）頭發(fā) 在揭開皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動數(shù)次，使細(xì)菌菌降落到瓊脂平板表面，然后蓋上皿蓋。（b）移去皿蓋將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。接種環(huán)通過前面劃的線條再在瓊脂的另一半，從上向下來回劃線到1/2處。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動的壓力不能太大，否則會刺破瓊脂。（f）劃線 另取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來回通過火焰數(shù)次。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動一下），立即閉合皿蓋。（d）取樣 將濕棉簽在實驗臺面或門旋鈕上擦拭約2平方厘米的范圍。（b）取棉簽 左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無名指夾持棉塞（或試管帽），將其取出，將管口很快地通過酒精燈的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出放回棉塞（或試管帽），并將空試管放在試管架上。一小時后蓋上兩個皿蓋。用記號筆寫上班級、姓名、日期，本次實驗還要寫上樣品來源，字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。1．做記號任何一個實驗，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號，培養(yǎng)皿的記號一般在皿底上。三、器材培養(yǎng)基平板，無菌水，滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈，酒精瓶，記號筆，廢物缸，牙簽等。每一種微生物所形成的菌落都有它自己的特點，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。2．比較來自不同場所與不同環(huán)境條件下微生物的數(shù)量和類型。五、實驗報告1．如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。㎏/㎝2，℃，30分鐘滅菌。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，使鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。2．放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。三、器材微生物培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿（12套一包），手提式高壓蒸汽菌鍋，實驗材料等。㎏/㎝2（8磅/英寸2），℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，℃，20分鐘滅菌，然后以無菌操作加入滅菌的糖溶液。表1 滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度(℃)2/3空氣排出時的溫度(℃)1/2空氣排出時的溫度(℃)1/3空氣排出時的溫度(℃)空氣全不排出時的溫度(℃)千克(公斤/厘米2)(kg/㎝2)磅/ 英寸2(lb/in2)5101520253010010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121㎏/㎝2，℃15—30分鐘可達(dá)到徹底滅菌的目的。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，（千焦）的熱量。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。2．學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。10．無菌檢查　將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。7．包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。（2）固體分裝 分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三解瓶的量不超過三角燒瓶容積的一半為宜。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。3．調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L NaOH ，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至達(dá)到所需pH值。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。2．溶化在裝有試劑和藥品的燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。7H2O，KH2PO4，麥芽糖，乳糖，溴甲酚紫，乙醇；1mol/L NaOH，1mo