【正文】 l/L HCL；試管，中套管，小倒管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙（—）棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布，蒸餾水等。3H2O，MgSO4根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制。二、基本原理培養(yǎng)基是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長(zhǎng)的需要配制而成的一種混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)或分離各種微生物。接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度（μm）低倍鏡高倍鏡油 鏡接目鏡倍數(shù)_______________________2．在高倍鏡和油鏡下測(cè)量枯草芽孢桿菌大小，將結(jié)果填入下表。3．取出目鏡測(cè)微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺分別用擦鏡紙擦試后，放回盒內(nèi)保存。兩對(duì)重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)10兩對(duì)重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每小格長(zhǎng)度（μm）=2105=4μm 同法校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。例如實(shí)驗(yàn)圖4④中A(目鏡測(cè)微尺)上5格對(duì)準(zhǔn)B鏡臺(tái)測(cè)微尺上的2格，B的1格為10μm,2格的長(zhǎng)度為20μm,所以目鏡測(cè)微尺上1小格的長(zhǎng)度為4μm 。圖4 目測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺①目鏡測(cè)微尺②鏡臺(tái)測(cè)微尺③鏡臺(tái)測(cè)微尺的中心部放大④鏡臺(tái)測(cè)微尺標(biāo)實(shí)目鏡測(cè)微尺時(shí)兩者重疊 （2）放置鏡臺(tái)測(cè)微尺 將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于顯微鏡的載物臺(tái)上，使刻度面朝上。三、器材枯草芽孢桿菌染色玻片標(biāo)本，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，顯微鏡，擦鏡紙，香柏油二甲苯等。圖3 目鏡測(cè)微尺A．　目鏡測(cè)微尺；A． 旋開接目鏡透鏡，放入目鏡測(cè)微尺；B． 將接目鏡插回鏡筒目鏡測(cè)微尺（圖3，A）是一塊可放在接目鏡內(nèi)的隔板上的圓形小玻片，其中央刻有精確的刻度，有等分50小格或100小格兩種，每5小格間有一長(zhǎng)線相隔。一般將1㎜等分為100格（2㎜等分為200格），㎜（即10μm）。用來測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測(cè)微尺（圖3）和鏡臺(tái)測(cè)微尺（圖4）。二、基本原理微生物細(xì)胞大小，是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。5．清洗血球計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。若選用2516規(guī)格的計(jì)數(shù)板則每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中方格，可選4個(gè)角和中央的中格（即80個(gè)小格），若選用1625規(guī)格的計(jì)數(shù)板，則數(shù)四個(gè)角：左上、右上、左下、右下的四個(gè)中方格，（即100小格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。靜置5—10分鐘即可計(jì)數(shù)。3．加樣品將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。2．鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。其計(jì)算方法如下：1．1625的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式細(xì)胞數(shù) ml=(100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) 100)4001000稀釋倍數(shù)2．2516的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式細(xì)胞數(shù) ml=(80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) 80)4001000稀釋倍數(shù)三、器材酵母菌懸液，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)管等。所以無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。二、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。2．作革蘭氏染色涂片時(shí)為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？3．當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實(shí)驗(yàn)九 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一、目的要求1．明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。（5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。（3）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。（注意涂片不可過于濃厚）4．染色（1）初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。再用無菌的接種環(huán)挑取少量2號(hào)菌種與右邊水滴充分混合成僅有2號(hào)菌的區(qū)域，并將少量菌液由右向左延伸至玻片的中央，使1號(hào)菌和2號(hào)菌在玻片的中央混合成含有兩種菌的混合區(qū)。2．涂片　本實(shí)驗(yàn)采用“三區(qū)”涂片法。三、器材大腸桿菌菌種（1號(hào)菌種），枯草芽孢桿菌菌種（2號(hào)菌種）；革蘭氏染色的四種染液，載玻片，顯微鏡，接種環(huán)，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水或無菌水，玻璃鉛筆，吸水紙，火柴，小燒杯，酒精瓶，酒精燈，試管架，攝子等。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95%的酒精（ethanol）。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫（crystal violet）。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G表示。二、基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。2．觀察細(xì)菌的各種形態(tài)結(jié)構(gòu)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．繪出你所觀察到的經(jīng)單染色的兩種細(xì)菌形態(tài)圖。沖洗后，將標(biāo)本晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，待完全干燥后才可置油鏡下觀察。5．水洗 染色時(shí)間到后，用自來水沖洗，直至沖下之水無色時(shí)為止。4．染色 放標(biāo)本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色時(shí)間長(zhǎng)短隨不同染色液而定。3．固定 涂片面向上，于火焰上通過2—3次，使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)菌的形態(tài)，并使其不易脫落。注意滴生理鹽水時(shí)不宜過多，涂片必須均勻，挑取菌種時(shí)切勿將培養(yǎng)基挑破。三、器材顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，玻璃鉛筆，吸水紙，試管架，火柴，小燒杯，酒精瓶等；　呂氏堿性染色液，石炭酸復(fù)紅染色液；金黃色葡萄球菌菌種，枯草芽孢桿菌菌種。常用的堿性染料除美藍(lán)外，還有結(jié)晶紫（crystal violet）、堿性復(fù)紅（basic fuchsin）、番紅（又稱沙黃，safranine）等。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時(shí)染料離子帶正電，易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形態(tài)的觀察。2．鞏固顯微鏡的使用方法。常見的有殼吸管蟲（Acineta）、足吸管蟲（Podophrya）和錘吸管蟲（Tokophrya）。常見種類有肋楯纖蟲（Aspidisca costata）、尖毛蟲（Oxytricha）、棘尾蟲（Stylonychia）、瘦尾蟲（Uroleptus）等。③下毛蟲（Hypotrichida）：背面隆起，腹面扁平，纖毛融合成觸毛，分布在腹面一定的地區(qū)，又分前觸毛、腹觸毛、臀觸毛、尾觸毛和緣觸毛，用觸毛支撐蟲體，負(fù)有“足”的作用。①自由游動(dòng)的纖毛蟲：游泳時(shí)常匍匐爬行在雜質(zhì)中，常見的有斜管蟲（Chilodonella）、漫游蟲（Litonotus）、前管蟲（Prorodon）、腎形蟲（Colpoda）、草履蟲（Paramecium）等。纖毛的多少和分布的位置不同，或周生于表面或一部分生長(zhǎng)著許多纖毛，靠纖毛有節(jié)奏地?cái)[動(dòng)而游泳。（3）纖毛蟲（Ciliata）：纖毛蟲是原生動(dòng)物中進(jìn)化到高一級(jí)的類群，在結(jié)構(gòu)上比較復(fù)雜。個(gè)體大小可由幾個(gè)微米到幾百個(gè)微米。內(nèi)外質(zhì)分界明顯，外質(zhì)透明，內(nèi)質(zhì)泡狀或顆粒狀。常見種類有：聚屋滴蟲（Oikomonas socialis）、尾波豆蟲（Bodo caudatus）、跳側(cè)滴蟲（Pleuromonas jaculans）、領(lǐng)鞭毛蟲（Choanoflagellate）。通常有卵圓形、橢圓形、杯形、雙錐形及多角形等等。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告將你在顯微鏡下觀察到的原生動(dòng)物形態(tài)繪制成圖，它屬于哪一類（見本課教材和附注）？有何特征？六、附注（一）根據(jù)藻類所含的色素和植物體的形態(tài)與構(gòu)造分成10門。3．高倍鏡觀察　用低倍鏡調(diào)準(zhǔn)焦距后，換高倍鏡，若有點(diǎn)模糊，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)至清晰。2．低倍鏡觀察　將標(biāo)本片置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦后，再輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋以便得到清晰的物像。2．借助顯微鏡觀察藻類個(gè)體形態(tài)，通過實(shí)驗(yàn)了解藻類的特征，細(xì)胞等的構(gòu)成，是藻類分類的重要依據(jù)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告。4．染色半小時(shí)后，再觀察一下死細(xì)胞數(shù)是否增加。3．將制好的水浸片放置3分鐘后鏡檢。2．用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。四、操作步驟1．%呂氏堿性美藍(lán)染液，液滴不可過多或過少，以免蓋上蓋玻片時(shí)，溢出或留有氣泡。因此，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的，用它來對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用。繁殖方式也較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。、活細(xì)胞的染色方法。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告。（3），并用無菌玻璃刮棒涂抹均勻。（1）向霉菌斜面試管中加入5ml無菌水，洗下孢子，制成孢子懸液。（3）用滅菌的尖細(xì)接種針，?。ㄈ庋鄯侥芸匆姷模┮稽c(diǎn)霉菌孢子，輕輕點(diǎn)在瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子夾著立在載玻片旁的蓋玻片蓋在瓊脂塊上，再蓋上皿蓋。2．載玻片觀察法（1）將略小于培養(yǎng)皿底內(nèi)徑的濾紙放入皿內(nèi)，再放上U形玻棒，其上放一潔凈的載玻片，然后將二個(gè)蓋玻片分別斜立在載玻片的兩端，蓋上皿蓋，把數(shù)套（根據(jù)需要而定）如此裝置的培養(yǎng)皿疊起，包扎好，㎏/㎝2，℃滅菌20分鐘，備用。（2）于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣外取少量帶有孢子的菌絲置染色液中，再細(xì)心地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。三、器材曲霉（Aspergillus sp.），青霉 (Penicillium sp.)，根霉(Rhizopus sp.)，毛霉(Mucor sp.)；乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，20%甘油，馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基平板或查氏培養(yǎng)基平板，無菌吸管，載玻片，蓋玻片，U形棒，解剖刀，玻璃紙，濾紙等。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片其特點(diǎn)是（a）細(xì)胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間；（c）溶液本身呈藍(lán)色，有一定染色效果。？實(shí)驗(yàn)四　霉菌的個(gè)體形態(tài)觀察一、目的要求掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。用油鏡觀察孢子絲的形態(tài)及孢子排列情況。將培養(yǎng)體表面貼在涂有樹膠的玻片上，用另一玻片輕輕按壓（不要壓碎），然后將放線菌培養(yǎng)體小心棄去，注意不要使培養(yǎng)體在玻片上滑動(dòng)，否則印痕模糊不清。（3）取干凈載玻片一塊，在玻片中央加一小滴加拿大樹膠，使樹膠攤成一薄層，放置數(shù)分鐘，使略微晾干（但不要過分干燥）。（2）取清潔的蓋玻片一塊，在菌落上面輕輕按壓一下，然后將印有痕跡的一面朝下放在有一滴呂氏堿性美藍(lán)染液的載玻片上，將孢子等印浸在染液中，制成印片。一般情況是氣生菌絲顏色較深，并比營(yíng)養(yǎng)菌絲粗二倍左右。（2）用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)，然后將孢子懸液（濃度以稀釋102—103為好），接種在蓋玻片與平皿培養(yǎng)基的界面上。（4）干燥后，用油鏡觀察營(yíng)養(yǎng)菌絲的形態(tài)。（2）用另一載玻片將其壓碎，棄去培養(yǎng)基，制成涂片，干燥、固定。然后進(jìn)行濕熱滅菌，備用。附：玻璃紙滅菌方法：在玻璃紙滅菌時(shí)，若直接將干燥的玻璃紙滅菌，它就會(huì)縮小，不便使用。取出培養(yǎng)皿，打開皿蓋，用鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分開，再用剪刀剪取小片長(zhǎng)有菌的玻璃紙，菌面朝上放在載玻片的水面上，使紙平貼載玻片。（4），接種在玻璃紙上，并用無菌玻璃棒涂勻后，置28℃培養(yǎng)，直至菌長(zhǎng)好，備用。（2）用經(jīng)火焰滅過菌的小鑷子將滅菌優(yōu)質(zhì)玻璃紙平鋪在平皿培養(yǎng)基上，如果瓊脂培養(yǎng)基和玻璃紙之間有氣泡，可以用滅過菌的玻璃棒將氣泡除去。三、器材顯微鏡，載玻片，蓋玻片，玻璃棒，接種鏟，小刀，鑷子，土樣，石炭酸復(fù)紅染液，呂氏堿性美藍(lán)染液，加拿大樹膠，玻璃紙，高氏1號(hào)培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿等。孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。二、基本原理放線菌在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長(zhǎng)而得名。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告？分別是？、高倍鏡和油鏡下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖。（6）將各部分還原，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。（5）觀察完畢，關(guān)閉電源，上旋鏡筒。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再?gòu)膫?cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。（3）從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì)損壞鏡頭。（1）用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2㎝，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。如果高倍鏡觸及載玻片應(yīng)立即停止旋動(dòng)，說明原來低倍鏡