【正文】 放線菌培養(yǎng)基平板、霉菌培養(yǎng)基平板、酒精燈、酒精瓶、接種環(huán)，接種針等。四、菌落形態(tài)特征的觀察由于微生物個體表面結(jié)構(gòu)、分裂方式、運動能力、生理特性及產(chǎn)生色素的能力等各不相同，個體及它們的群體在固體培養(yǎng)基上生長狀況各不一樣，按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落特征，可粗略辨別是何種類型的微生物，應(yīng)注意菌落的形狀、大小、表面結(jié)構(gòu)、邊緣結(jié)構(gòu)、菌叢高度、顏色、透明度、氣味、粘滯性、質(zhì)地軟硬情況、表面光滑與粗糙情況等。五、微生物的計數(shù)與分類1．細(xì)菌菌落形態(tài)特征觀察2．放線菌菌落形態(tài)特征觀察3．霉菌菌落形態(tài)特征觀察六、實驗報告1．通過本次實驗?zāi)阏J(rèn)識了幾種微生物？2．分別描述本次實驗?zāi)阏J(rèn)識的幾種微生物的菌落特征。3．各類微生物的數(shù)量是多少？實驗十五 空氣中微生物的檢測技術(shù)一、目的要求1．學(xué)習(xí)空氣中微生物的檢測技術(shù)2．體會無菌操作的重要性二、基本原理被微生物污染的空氣是呼吸道傳染病的主要傳播途徑。本實驗采用環(huán)境監(jiān)測中的微生物學(xué)沉降的方法，對空氣中微生物進(jìn)行計數(shù)。空氣中的微生物自然沉降于培養(yǎng)基的表面，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)其上生長的菌落數(shù)，按公式計算1m3空氣中的微生物總數(shù)。培養(yǎng)基平板含有微生物生長所需要的營養(yǎng)成分，來源不同的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜的溫度下培養(yǎng)后形成一個可見的群體的集落，稱為菌落。通過培養(yǎng)基平板檢查空氣環(huán)境中微生物數(shù)量和類型，可用于測定空氣質(zhì)量和污染指數(shù)的評定。三、器材高壓蒸汽滅菌器、恒溫箱、冰箱、培養(yǎng)皿、吸管等；肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基四、操作步驟（1）將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基溶化后，各倒8個平皿。（2）將上述三種培養(yǎng)皿各取四個。在室外打開皿蓋，分別暴露于空氣中5分鐘、10分鐘。另四個培養(yǎng)皿，在實驗室空氣中分別暴露5分鐘、10分鐘（一般不同時間各平行三皿）。（3）自行設(shè)計實驗內(nèi)容如不同環(huán)境、不同暴露時間。（4）蓋上皿蓋，將平板倒置，置于28℃溫箱中，細(xì)菌培養(yǎng)48小時，霉菌與放線菌培養(yǎng)時間分別為4—6天，計算其菌落數(shù)，觀察菌落形態(tài)、顏色等。（5）計算1m3空氣中微生物的數(shù)目奧梅染斯基（Омелянский）曾建議：如面積為100㎝2的平板培養(yǎng)基，暴露在空氣中5分鐘，置于37℃培養(yǎng)24小時后所生長的菌落數(shù)，相當(dāng)于10L空氣中的細(xì)菌數(shù)。N100100πｒ2X=X：每m3空氣中的細(xì)菌數(shù)N：平板暴露5分鐘，置37℃培養(yǎng)24小時后生長的菌落數(shù)r：平皿底半徑（㎝）五、實驗報告 菌落平均數(shù)環(huán)境細(xì)菌霉菌放線菌室外5min10min室內(nèi)5min10min2．用沉降法計算1m3空氣環(huán)境中所含菌數(shù)。3．對沉降測定法的結(jié)果，進(jìn)行分析。實驗十六 土壤中微生物的檢測技術(shù)一、目的要求1．掌握倒培養(yǎng)基平板的方法　　2．學(xué)習(xí)分離純化微生物的基本操作技術(shù)。二、基本原理在土壤、水、空氣或及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化微生物，直至得到純菌株。三、器材高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁瓊脂培養(yǎng)基，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，土樣等。四、操作步驟1．稀釋涂布平板法（1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至55—60℃時，然后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則瓶塞不必夾在手指中。瓶口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。最好是將平板放室溫2—3天，或37℃培養(yǎng)24小時，檢查無菌落及皿蓋無冷凝水后再使用。（2）制備土壤稀釋液 稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制成101010101010各種稀釋度的土壤溶液。（3）涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上10105和106三種稀釋度，然后用三支1ml無菌吸管分別由10用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。（4）培養(yǎng) 將高氏1號培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板，倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3—5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)1—2日。（5）挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。2．稀釋混合平板法稀釋混合平板法與稀釋涂布平板法的操作基本相同，無菌操作也一樣，、10106稀釋度的土壤懸液對號放入平皿，然后再倒入溶化后冷卻到45℃左右的培養(yǎng)基，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合均勻，待冷凝成平板后，分別倒置于28℃和37℃溫室中培養(yǎng)后，再挑取單個菌落，直到獲得純培養(yǎng)。3．平板劃線分離法（1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。（2）劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述101的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有兩種：(a)用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3—4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70186。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。(b)將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。（3）挑菌 同稀釋涂布平板法，直到獲得純培養(yǎng)。五、實驗報告1．在你所實驗的三種培養(yǎng)基平板上，長出的菌落分屬于哪個類群？簡述它們的菌落形態(tài)特征。2．每一類群菌落總數(shù)是多少？3．在平板劃線（a）中，為什么每次都需將接種環(huán)上的剩余物燒掉?實驗十七 水中細(xì)菌總數(shù)的測定一、目的要求1．學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測定的方法。2．了解培養(yǎng)基平板菌落計數(shù)原則。二、基本原理本實驗采用平板計數(shù)技術(shù)測定水中細(xì)菌總數(shù)。細(xì)菌總數(shù)主要作為判定被檢水樣污染程度的標(biāo)志。在水質(zhì)衛(wèi)生學(xué)檢驗中，細(xì)菌總數(shù)是指1ml水樣在肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，置37℃經(jīng)24小時培養(yǎng)后，所生長的細(xì)菌菌落的總數(shù)。我國生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定生活飲用水的細(xì)菌總數(shù)1ml中不得超過100個。三、器材肉膏蛋白胨脂培養(yǎng)基，滅菌水，冰箱，滅菌三角燒瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管，滅菌試管等。四、操作步驟1．水樣的采取供細(xì)菌學(xué)檢驗用的水樣，必須按無菌操作的基本要求進(jìn)行采樣，并保證在運送，貯存過程中不受污染。為了要正確反映水質(zhì)在采樣時的真實情況，水樣在采取后應(yīng)立即送檢，一般從取樣到檢驗不應(yīng)超過4小時。條件不允許立即檢驗時，應(yīng)存于冰箱，但也不應(yīng)超過24小時，并應(yīng)在檢驗報告單上注明。（1）自來水 先將自來水龍頭用火焰燒灼3分鐘滅菌，再開放水龍頭使水流5分鐘后，用滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。（2）池水、河水或湖水 應(yīng)取距水面10—15㎝的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出，最好立即檢查，否則需放入冰箱中保存。2．細(xì)菌總數(shù)測定（1）自來水(a)用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。共做三個平皿。(b)分別傾注約15ml已溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立 即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。(c)另取三空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15ml，作空白對照。(d)培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃溫箱中，培養(yǎng)24小時，進(jìn)行菌落計數(shù)。三個平板的平均菌落數(shù)即為1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)。（2）池水、河水或湖水等(a)稀釋水樣 取3個滅菌空試管，分別加入9ml滅菌水。取1ml水樣注入第一管9ml滅菌水內(nèi)，搖勻，再從第一管取1ml至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10102與103。稀釋倍數(shù)看水樣污濁程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30—300個之間的稀釋度最為合適，若三個稀釋度的菌數(shù)均多到無法計數(shù)或少到無法計數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。一般中等污穢水樣，取10102與103三個連續(xù)稀釋度，污穢嚴(yán)重的取1010104三個連續(xù)稀釋度。(b)自最后三個稀釋度的試管中各取1ml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做三個培養(yǎng)皿。(c)各傾注15ml已溶化并冷卻至45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，立即放在桌上搖勻。(d)凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。3．菌落計數(shù)方法（1）先計算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個培養(yǎng)皿有較大片狀菌苔生長時，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無片狀菌苔生長的培養(yǎng)皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到培養(yǎng)皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全培養(yǎng)皿的菌落數(shù)，然后再計算該稀釋度的平均菌落數(shù)。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30—300之間的，當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。（3）若有兩個稀釋度的平均菌落數(shù)均在30—300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)。若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)。（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30—300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)菌落總數(shù)（個/ml）報告方式（個/ml）備注101102103113651642016400104兩位以后的數(shù)字采取四舍五入的方法去掉2276029546377001043289027160271001044無法計數(shù)16505135130001055271152701026無法計數(shù)3051230500104表 2計算菌落總數(shù)方法舉例五、實驗報告1．1ml自來水中細(xì)菌總數(shù)是多少？2．1ml湖水中細(xì)菌總數(shù)是多少？3．經(jīng)檢驗的自來水是否合乎飲用水的標(biāo)準(zhǔn)？為什么？實驗十八 水中大腸菌群的測定及結(jié)果分析一、目的要求1．學(xué)習(xí)測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法。2．了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性。二、基本原理大腸菌群是評價水質(zhì)好壞的一個重要的衛(wèi)生指標(biāo)，也是反映水體被生活污水污染的一項重要監(jiān)測項目。大腸菌群是一群以大腸埃希氏菌（Escherichia　coli）為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在37℃生長時，能在48小時內(nèi)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定一升水樣中總大腸菌群數(shù)不超過三個。多管發(fā)酵法包括初發(fā)酵試驗、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗三個部分。發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。1．初發(fā)酵試驗水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37℃下培養(yǎng)，24小時內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果。48小時后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。2．平板分離初發(fā)酵管24至48小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，Endo′s medium）或伊紅美藍(lán)瓊脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上劃線分離菌落。3．復(fù)發(fā)酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過此試驗再進(jìn)一步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，經(jīng)24小時培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。三、器材圖5 多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的操作步驟和結(jié)果解釋乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍(lán)或復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂平板，滅菌水；載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管，革蘭氏染液，顯微鏡，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，滅菌三角瓶等。四、操作步驟1．水樣的采取同水中細(xì)菌總數(shù)的測定及結(jié)果分析2．自來水檢查（1）初發(fā)酵試驗 在2個含有50ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入100ml水樣。在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml水樣?；靹蚝螅?7℃培養(yǎng)24小時，24小時未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時。