【文章內(nèi)容簡介】 以滅菌即可，是一類既有成分精確又有使用方便等優(yōu)點的現(xiàn)代化培養(yǎng)基。 按目的用途基礎培養(yǎng)基：是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的（1）種子培養(yǎng)基 為了在較短時間內(nèi)獲得數(shù)量較多的強壯而整齊的種子細胞，需要使用種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富、氮源充足（2）發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基適用于合成發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基。 （ 3）保藏培養(yǎng)基細菌：營養(yǎng)瓊脂、LB培養(yǎng)基 放線菌：馬鈴薯培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基酵母：麥汁培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基 霉菌：麥汁培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基 （4）富集培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基A、富集培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基（如肉湯蛋白胨培養(yǎng)基）中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物。 常用于菌種篩選。B、選擇性培養(yǎng)基在培養(yǎng)基上加入相應的特殊營養(yǎng)物質(zhì),利于所需微生物的生長或加入相應化學物質(zhì)以殺死或抑制不需要的微生物，這樣的培養(yǎng)基稱為選擇性培養(yǎng)基。 用于將某種微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。①加富性選擇培養(yǎng)基 廣義：選擇培養(yǎng)基包括加富培養(yǎng)基。 ②抑制性選擇培養(yǎng)基 （5）鑒別性培養(yǎng)基最常見的鑒別性培養(yǎng)基是伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基，即EMB培養(yǎng)基。EMB培養(yǎng)基常用作區(qū)別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌。EMB培養(yǎng)基中伊紅和美藍的作用①伊紅Y是一種紅色酸性染料，美藍是一種藍色堿性染料。，菌體常帶H+，故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅和美藍結(jié)合，所以菌落染上深紫色，從菌落表面的反射光中還可看到綠色金屬閃光。②伊紅和美藍兩種苯胺染料還起著抑制G+細菌和一些難培養(yǎng)的G細菌生長的作用；③這兩種染料在低酸度時結(jié)合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。（6）生理特性測定培養(yǎng)基是在鑒定微生物時，用于觀察微生物的培養(yǎng)基特征，或觀測其生理生化反應所采用的培養(yǎng)基。第二節(jié) 微生物的生長微生物學中將在實驗條件下從一個單細胞繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。純培養(yǎng)的分離方法 單細胞挑取法 選擇培養(yǎng)基分離法 稀釋傾注平板法 稀釋涂布平板法 平板劃線分離法 一、微生物生長的測定微生物生長：單位時間里微生物數(shù)量或生物量（Biomass）的變化。 微生物生長的測定： 個體計數(shù)、群體重量測定、群體生理指標測定 （一）測生長量 （1）測體積法：粗放型，在刻度離心管中測沉降量 （2）稱干重法：精確型，離心法和過濾法獲得菌體細胞，微生物的干重一般為其濕重的10％～20％。 (1)比濁法 用分光光度法對無色的微生物懸浮液進行測定，一般選用600～700nm波段。(2)生理指標法 常用于對微生物的快速鑒定與檢測。一種特定的微生物，每一個細胞中的ATP濃度幾乎是一個常數(shù)，所以測定這種微生物的ATP含量，即可知其細胞數(shù)。 ATP濃度的測定： 在這個反應系統(tǒng)中，酶、熒光素和O2都過量時，光的強度與ATP的量成正比?？捎蒙锇l(fā)光儀測定光照強度，從而換算出ATP的濃度。 （二）計繁殖數(shù) 單細胞狀態(tài)的細菌和酵母菌——計算各個體的數(shù)目 放線菌和霉菌等絲狀生長的微生物——計算其孢子數(shù) (1) 計數(shù)板直接計數(shù)法 指采用計數(shù)板（細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板），在光學顯微鏡下直接觀察微生物細胞并進行計數(shù)的方法。1ml菌液中總菌數(shù) ：A/525104B 或A/516104B缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌難以觀察；(2)染色后活菌計數(shù)法 采用特定的染色技術(shù)進行活菌染色，然后用光學顯微鏡計數(shù)的方法?？煞謩e對活菌和死菌進行計數(shù)。例：美藍染色酵母 活細胞→無色 死細胞→藍色 (3)比例計數(shù)法死細胞→藍 將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細胞細胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測微生物細胞濃度(4)過濾計數(shù)法 當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積中）的細菌數(shù)。 (5)Coulter 電子計數(shù)器 菌體與液體導電性不同, 一個細胞通過小孔,電阻增加,形成一個脈沖。(6)菌絲長度 平板 U行管 是一種活菌計數(shù)法，這是一種依據(jù)活菌在液體培養(yǎng)基中會使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的原理而設計。 最常用的是菌落計數(shù)法（colonycounting methods）。 (1)平板菌落計數(shù)法 可用澆注平板（pour plate）或涂布平板（spread plate）等方法進行。此法適用于各種好氧菌或厭氧菌。 (2)膜過濾培養(yǎng)菌落計數(shù)法當樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對形成的菌落進行統(tǒng)計。(3)厭氧菌的菌落計數(shù)法 二、微生物個體細胞的生長細菌的生長 細菌培養(yǎng)物在培養(yǎng)條件下度過的時間稱為細菌的菌齡 酵母菌的生長 酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌細胞的生長——芽細胞的生長。 霉菌的生長 絲狀真菌的生長時從孢子萌發(fā)開始的，以其菌絲頂端延長的方式進行的。當菌絲伸長到一定程度后就會出現(xiàn)分枝 三、微生物群體細胞的生長（一）微生物生長的描述微生物生長通常以細胞重量或細胞數(shù)倍增所需要的時間為表征。在微生物學中提到的“生長”，均指群體生長。 （二）生物群體生長的規(guī)律分批培養(yǎng)采用分光光度計測定OD值的方法繪制細菌的生長曲線。 分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等4個時期 （1）延滯期（Lag phase）又稱停滯期、調(diào)整期和適應期 A、延滯期的特點:分裂遲緩、代謝活躍 ① 生長速率常數(shù)為零；② 細胞形態(tài)變大或增長 ③原生質(zhì)呈嗜堿性。細胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高； ④ 合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP合成加速，易產(chǎn)生各種誘導酶；⑤ 對外界不良條件敏感，如NaCI溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應敏感。B、遲緩期出現(xiàn)的原因: 調(diào)整代謝 C、生產(chǎn)實踐中縮短延滯期的常用手段 , 使延滯期縮短； ； ； ； （2）對數(shù)期 A、對數(shù)生長期的特點 ① 生長速率常數(shù)R最大，因而細胞每分裂一次所需的時間——代時G或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時間最短； ② 細胞進行平衡生長，菌體各部分的成分十分均勻；③ 酶系活躍，代謝旺盛；C、影響微生物增代時間（代時）的因素① 菌種，不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同； ② 營養(yǎng)成分，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短，反之則長； ③ 營養(yǎng)物濃度，營養(yǎng)物的濃度可影響微生物的生長速率和生長總量 ，在一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比； ④ 培養(yǎng)溫度，在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關。 （ stationary phase）又稱恒定期或最高生長期。其特點是生長速率常數(shù)R等于0，即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中 A、穩(wěn)定期特點細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段 (1)細胞內(nèi)開始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內(nèi)含物； (2)芽孢桿菌在這時開始形成芽孢或建立自然感受態(tài)等； (3)有的微生物在穩(wěn)定期時開始合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物（secondary metabolites）——穩(wěn)定期產(chǎn)物（idiolites）。B、穩(wěn)定期到來的原因 ① 營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡； ② 營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如C／N比值不合適等； ③ 酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積； ④ pH、氧化還原勢等理化條件越來越不適宜等。D、延長穩(wěn)定生長期的方法： 生產(chǎn)上常通過補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）或取走代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度、對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩等措施延長穩(wěn)定生長期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。（4）衰亡期（ decline phase或death phase）A、衰亡期的特點：①個體死亡的速度超過新生的速度，整個群體呈負生長；②細胞形態(tài)多樣，?？梢娀魏退ネ诵偷募毎?；③細菌代謝活性降低，細菌衰老并出現(xiàn)菌體自溶；④有些微生物在衰亡期產(chǎn)生或釋放對人類有用的次生代謝物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶、抗生素等；⑤產(chǎn)芽孢桿菌在此期中釋放芽孢。B、產(chǎn)生衰亡期的原因 外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，從而引起細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體死亡。真菌的生長曲線大致可分3個時期，即生長延滯期、快速生長期、生長衰退期。 同步生長同步培養(yǎng)法：使培養(yǎng)物中所有微生物細胞都處于相同的生長階段的培養(yǎng)法，稱為同步培養(yǎng)法。同步生長：通過同步培養(yǎng)的手段而使細胞群體中各個體處于分裂步調(diào)一致的狀態(tài)，即同時進行分裂的生長方式，稱為同步生長。同步培養(yǎng)物：通過同步培養(yǎng)方法獲得的細胞被稱為同步細胞或同步培養(yǎng)物。（1）環(huán)境條件控制技術(shù)（誘導法）采用物理、化學因子使微生物細胞生長進行到某個階段而停下來，使先到達該階段的微生物細胞不能進入下一生長階段，待全部群體細胞都到達該 生長階段后，再除去該因子，使全部群體細胞同時進入下一個生長階段，以達到誘導 微生物細胞同步生長的目的。⑵機械篩選法根據(jù)微生物細胞在不同生長階段的細胞體積與質(zhì)量或根據(jù)它們同某種材料結(jié)合能力不同的原理設計出來的方法。①離心法將不同步的細胞培養(yǎng)物懸浮在不被這種細菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通過密度梯度離心將不同細胞分布成不同的細胞帶，每一細胞帶的細胞大致是處于同一生長期的細胞，分別將它們?nèi)〕鲞M行培養(yǎng)，就可以獲得同步培養(yǎng)。②過濾分離法：將不同步的細胞培養(yǎng)物通過孔徑大小不同微孔濾器，從而將大小不同的細胞分開，分別將濾液中的細胞取出進行培養(yǎng)，獲得同步細胞。?、巯跛崂w維素膜法（膜洗脫法）根據(jù)某些濾膜可吸附與該濾膜相反電荷細胞的原理，讓非同步細胞的懸液流經(jīng)此膜，于是一大群細胞被牢牢吸附。然后將濾膜翻轉(zhuǎn)并置于濾器中，其上慢速留下新鮮培養(yǎng)液，最初流出的是未吸附的細胞，不久，吸附的細胞開始分裂，在分裂后的兩個子細胞中一個仍吸附在濾膜上，另一個則被培養(yǎng)液洗脫。若濾膜足夠大，只要收集剛滴下的子細胞培養(yǎng)液即可獲得滿意的同步培養(yǎng)細胞。硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長的方法同步生長往往只能維持23個世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機生長。 連續(xù)培養(yǎng)將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲；→分批培養(yǎng)（batch culture）或密閉培養(yǎng)（closed culture）→ 培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換。連續(xù)培養(yǎng)（Continous culture ）：又稱開放培養(yǎng)（open culture），在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。 重要特征：使微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)連續(xù)培養(yǎng)的類型按控制方式分：內(nèi)控制（控制菌體密度）恒濁器 外控制（控制培養(yǎng)液流速及R）：恒化器按培養(yǎng)器串聯(lián)級數(shù)分：單級連續(xù)培養(yǎng)器 多級連續(xù)培養(yǎng)器按細胞狀態(tài)分：一般連續(xù)培養(yǎng)器 固定化連續(xù)培養(yǎng)器按用途分：實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器 發(fā)酵生產(chǎn)用：大型連續(xù)發(fā)酵罐在整個培養(yǎng)過程中 ，通過控制培養(yǎng)液的流速保持不變，并使微生物始終在低于最高生長速率的條件下生長繁殖的連續(xù)培養(yǎng)裝置。在整個培養(yǎng)過程中，根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點：①高效，簡化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等許多單元操作，從而減少了非生產(chǎn)時間和提高了設備的利用率；②自控，即便于利用各種傳感器和儀表進行自動控制；③產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；④節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，使水、氣、電的負荷均衡合理。連續(xù)發(fā)酵的缺點：①菌種易退化—由于長期讓微生物處于高速率的細胞分裂中，故即使其自發(fā)突變率極低，仍無法避免突變的發(fā)生，尤其當發(fā)生比原生產(chǎn)菌株營養(yǎng)要求降低、生長速率增高、代謝產(chǎn)物減少的負變菌株時；②易污染雜菌，在長期的連續(xù)運轉(zhuǎn)中，存在著因設備滲漏、通氣過濾失靈等造成的污染；③營養(yǎng)物的利用率一般低于單批培養(yǎng)。第四章　微生物的代謝與調(diào)節(jié)及其人工控制生物能的產(chǎn)生1底物水平磷酸化 物質(zhì)在生物氧化過程中，常生成一些含有高能鍵的化合物而這些化合物可直接偶聯(lián)ATP或GTP的合成。這種產(chǎn)生ATP等高能分子的方式稱為底物水平磷酸化底物水平磷酸化既存在于發(fā)酵過程中也存在于呼吸過程中。2氧化磷酸化 物質(zhì)在生物氧化過程中形成的NADH和FADH2可通過位于線粒體內(nèi)膜和細菌質(zhì)膜上的電子傳遞系統(tǒng)將電子傳遞給氧或其他氧化型物質(zhì)，在這個過程中偶聯(lián)著ATP的合成，這種產(chǎn)能方式稱為氧化磷酸化。在典型的呼吸鏈中，即電子通過典型的NAD+呼吸鏈傳遞時，只有三處能提供合成ATP所需要的足夠能量。因此，在2 [H] 從NADH2傳遞至O2的過程中，只有三處能與磷酸化反應（ADP+Pi ATP）相偶聯(lián)，所以產(chǎn)生3分子ATP。電子通過FAD呼吸鏈傳遞時，因為只有二處能與ADP磷酸化相偶聯(lián)，故僅產(chǎn)生2分子ATP?？梢?，氧化磷酸化效率是NAD+呼吸鏈高于FAD呼吸鏈。這種關系用數(shù)量來表示稱為P/O比（即molATP/mol氧原子）。化學滲透偶聯(lián)學說 由于ATP在生命活動中所起的重要作用，闡明ATP合成的具體機制長期以來一直是人們的研究熱點，至今能被許多學者認可的是英國學者米切爾（)1961年提出1978年獲諾貝爾獎的 化學滲透學說。該學說認為，在氧化磷酸化