【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 以滅菌即可，是一類既有成分精確又有使用方便等優(yōu)點(diǎn)的現(xiàn)代化培養(yǎng)基。 按目的用途基礎(chǔ)培養(yǎng)基：是含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的（1）種子培養(yǎng)基 為了在較短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量較多的強(qiáng)壯而整齊的種子細(xì)胞，需要使用種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富、氮源充足（2）發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基適用于合成發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基。 （ 3）保藏培養(yǎng)基細(xì)菌：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB培養(yǎng)基 放線菌：馬鈴薯培養(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基酵母：麥汁培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基 霉菌：麥汁培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基 （4）富集培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基A、富集培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基（如肉湯蛋白胨培養(yǎng)基）中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來(lái)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物。 常用于菌種篩選。B、選擇性培養(yǎng)基在培養(yǎng)基上加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),利于所需微生物的生長(zhǎng)或加入相應(yīng)化學(xué)物質(zhì)以殺死或抑制不需要的微生物，這樣的培養(yǎng)基稱為選擇性培養(yǎng)基。 用于將某種微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基。①加富性選擇培養(yǎng)基 廣義：選擇培養(yǎng)基包括加富培養(yǎng)基。 ②抑制性選擇培養(yǎng)基 （5）鑒別性培養(yǎng)基最常見的鑒別性培養(yǎng)基是伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基，即EMB培養(yǎng)基。EMB培養(yǎng)基常用作區(qū)別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌。EMB培養(yǎng)基中伊紅和美藍(lán)的作用①伊紅Y是一種紅色酸性染料，美藍(lán)是一種藍(lán)色堿性染料。，菌體常帶H+，故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅和美藍(lán)結(jié)合，所以菌落染上深紫色，從菌落表面的反射光中還可看到綠色金屬閃光。②伊紅和美藍(lán)兩種苯胺染料還起著抑制G+細(xì)菌和一些難培養(yǎng)的G細(xì)菌生長(zhǎng)的作用；③這兩種染料在低酸度時(shí)結(jié)合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。（6）生理特性測(cè)定培養(yǎng)基是在鑒定微生物時(shí)，用于觀察微生物的培養(yǎng)基特征，或觀測(cè)其生理生化反應(yīng)所采用的培養(yǎng)基。第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)條件下從一個(gè)單細(xì)胞繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。純培養(yǎng)的分離方法 單細(xì)胞挑取法 選擇培養(yǎng)基分離法 稀釋傾注平板法 稀釋涂布平板法 平板劃線分離法 一、微生物生長(zhǎng)的測(cè)定微生物生長(zhǎng)：?jiǎn)挝粫r(shí)間里微生物數(shù)量或生物量（Biomass）的變化。 微生物生長(zhǎng)的測(cè)定： 個(gè)體計(jì)數(shù)、群體重量測(cè)定、群體生理指標(biāo)測(cè)定 （一）測(cè)生長(zhǎng)量 （1）測(cè)體積法：粗放型，在刻度離心管中測(cè)沉降量 （2）稱干重法：精確型，離心法和過(guò)濾法獲得菌體細(xì)胞，微生物的干重一般為其濕重的10％～20％。 (1)比濁法 用分光光度法對(duì)無(wú)色的微生物懸浮液進(jìn)行測(cè)定，一般選用600～700nm波段。(2)生理指標(biāo)法 常用于對(duì)微生物的快速鑒定與檢測(cè)。一種特定的微生物，每一個(gè)細(xì)胞中的ATP濃度幾乎是一個(gè)常數(shù)，所以測(cè)定這種微生物的ATP含量，即可知其細(xì)胞數(shù)。 ATP濃度的測(cè)定： 在這個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，酶、熒光素和O2都過(guò)量時(shí)，光的強(qiáng)度與ATP的量成正比。可用生物發(fā)光儀測(cè)定光照強(qiáng)度，從而換算出ATP的濃度。 （二）計(jì)繁殖數(shù) 單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌——計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目 放線菌和霉菌等絲狀生長(zhǎng)的微生物——計(jì)算其孢子數(shù) (1) 計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法 指采用計(jì)數(shù)板（細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板），在光學(xué)顯微鏡下直接觀察微生物細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。1ml菌液中總菌數(shù) ：A/525104B 或A/516104B缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌難以觀察；(2)染色后活菌計(jì)數(shù)法 采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行活菌染色，然后用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)的方法。可分別對(duì)活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。例：美藍(lán)染色酵母 活細(xì)胞→無(wú)色 死細(xì)胞→藍(lán)色 (3)比例計(jì)數(shù)法死細(xì)胞→藍(lán) 將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測(cè)細(xì)胞細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測(cè)微生物細(xì)胞濃度(4)過(guò)濾計(jì)數(shù)法 當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的樣品通過(guò)膜過(guò)濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上（或一定面積中）的細(xì)菌數(shù)。 (5)Coulter 電子計(jì)數(shù)器 菌體與液體導(dǎo)電性不同, 一個(gè)細(xì)胞通過(guò)小孔,電阻增加,形成一個(gè)脈沖。(6)菌絲長(zhǎng)度 平板 U行管 是一種活菌計(jì)數(shù)法，這是一種依據(jù)活菌在液體培養(yǎng)基中會(huì)使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的原理而設(shè)計(jì)。 最常用的是菌落計(jì)數(shù)法（colonycounting methods）。 (1)平板菌落計(jì)數(shù)法 可用澆注平板（pour plate）或涂布平板（spread plate）等方法進(jìn)行。此法適用于各種好氧菌或厭氧菌。 (2)膜過(guò)濾培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過(guò)膜過(guò)濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(3)厭氧菌的菌落計(jì)數(shù)法 二、微生物個(gè)體細(xì)胞的生長(zhǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng) 細(xì)菌培養(yǎng)物在培養(yǎng)條件下度過(guò)的時(shí)間稱為細(xì)菌的菌齡 酵母菌的生長(zhǎng) 酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌細(xì)胞的生長(zhǎng)——芽細(xì)胞的生長(zhǎng)。 霉菌的生長(zhǎng) 絲狀真菌的生長(zhǎng)時(shí)從孢子萌發(fā)開始的，以其菌絲頂端延長(zhǎng)的方式進(jìn)行的。當(dāng)菌絲伸長(zhǎng)到一定程度后就會(huì)出現(xiàn)分枝 三、微生物群體細(xì)胞的生長(zhǎng)（一）微生物生長(zhǎng)的描述微生物生長(zhǎng)通常以細(xì)胞重量或細(xì)胞數(shù)倍增所需要的時(shí)間為表征。在微生物學(xué)中提到的“生長(zhǎng)”，均指群體生長(zhǎng)。 （二）生物群體生長(zhǎng)的規(guī)律分批培養(yǎng)采用分光光度計(jì)測(cè)定OD值的方法繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。 分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等4個(gè)時(shí)期 （1）延滯期（Lag phase）又稱停滯期、調(diào)整期和適應(yīng)期 A、延滯期的特點(diǎn):分裂遲緩、代謝活躍 ① 生長(zhǎng)速率常數(shù)為零；② 細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng) ③原生質(zhì)呈嗜堿性。細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高； ④ 合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶；⑤ 對(duì)外界不良條件敏感，如NaCI溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應(yīng)敏感。B、遲緩期出現(xiàn)的原因: 調(diào)整代謝 C、生產(chǎn)實(shí)踐中縮短延滯期的常用手段 , 使延滯期縮短； ； ； ； （2）對(duì)數(shù)期 A、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的特點(diǎn) ① 生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大，因而細(xì)胞每分裂一次所需的時(shí)間——代時(shí)G或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時(shí)間最短； ② 細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體各部分的成分十分均勻；③ 酶系活躍，代謝旺盛；C、影響微生物增代時(shí)間（代時(shí)）的因素① 菌種，不同的微生物及微生物的不同菌株代時(shí)不同； ② 營(yíng)養(yǎng)成分，在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)代時(shí)短，反之則長(zhǎng)； ③ 營(yíng)養(yǎng)物濃度，營(yíng)養(yǎng)物的濃度可影響微生物的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)總量 ，在一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)物濃度呈正比； ④ 培養(yǎng)溫度，在一定范圍，生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。 （ stationary phase）又稱恒定期或最高生長(zhǎng)期。其特點(diǎn)是生長(zhǎng)速率常數(shù)R等于0，即處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)相等的動(dòng)態(tài)平衡之中 A、穩(wěn)定期特點(diǎn)細(xì)胞重要的分化調(diào)節(jié)階段 (1)細(xì)胞內(nèi)開始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內(nèi)含物； (2)芽孢桿菌在這時(shí)開始形成芽孢或建立自然感受態(tài)等； (3)有的微生物在穩(wěn)定期時(shí)開始合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物（secondary metabolites）——穩(wěn)定期產(chǎn)物（idiolites）。B、穩(wěn)定期到來(lái)的原因 ① 營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡； ② 營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如C／N比值不合適等； ③ 酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積； ④ pH、氧化還原勢(shì)等理化條件越來(lái)越不適宜等。D、延長(zhǎng)穩(wěn)定生長(zhǎng)期的方法： 生產(chǎn)上常通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）或取走代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度、對(duì)好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩等措施延長(zhǎng)穩(wěn)定生長(zhǎng)期，以獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物。（4）衰亡期（ decline phase或death phase）A、衰亡期的特點(diǎn)：①個(gè)體死亡的速度超過(guò)新生的速度，整個(gè)群體呈負(fù)生長(zhǎng)；②細(xì)胞形態(tài)多樣，?？梢娀魏退ネ诵偷募?xì)胞；③細(xì)菌代謝活性降低，細(xì)菌衰老并出現(xiàn)菌體自溶；④有些微生物在衰亡期產(chǎn)生或釋放對(duì)人類有用的次生代謝物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶、抗生素等；⑤產(chǎn)芽孢桿菌在此期中釋放芽孢。B、產(chǎn)生衰亡期的原因 外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來(lái)越不利，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過(guò)合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。真菌的生長(zhǎng)曲線大致可分3個(gè)時(shí)期，即生長(zhǎng)延滯期、快速生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)衰退期。 同步生長(zhǎng)同步培養(yǎng)法：使培養(yǎng)物中所有微生物細(xì)胞都處于相同的生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)法，稱為同步培養(yǎng)法。同步生長(zhǎng)：通過(guò)同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的狀態(tài)，即同時(shí)進(jìn)行分裂的生長(zhǎng)方式，稱為同步生長(zhǎng)。同步培養(yǎng)物：通過(guò)同步培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞被稱為同步細(xì)胞或同步培養(yǎng)物。（1）環(huán)境條件控制技術(shù)（誘導(dǎo)法）采用物理、化學(xué)因子使微生物細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行到某個(gè)階段而停下來(lái)，使先到達(dá)該階段的微生物細(xì)胞不能進(jìn)入下一生長(zhǎng)階段，待全部群體細(xì)胞都到達(dá)該 生長(zhǎng)階段后，再除去該因子，使全部群體細(xì)胞同時(shí)進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)階段，以達(dá)到誘導(dǎo) 微生物細(xì)胞同步生長(zhǎng)的目的。⑵機(jī)械篩選法根據(jù)微生物細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞體積與質(zhì)量或根據(jù)它們同某種材料結(jié)合能力不同的原理設(shè)計(jì)出來(lái)的方法。①離心法將不同步的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮在不被這種細(xì)菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通過(guò)密度梯度離心將不同細(xì)胞分布成不同的細(xì)胞帶，每一細(xì)胞帶的細(xì)胞大致是處于同一生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別將它們?nèi)〕鲞M(jìn)行培養(yǎng)，就可以獲得同步培養(yǎng)。②過(guò)濾分離法：將不同步的細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)孔徑大小不同微孔濾器，從而將大小不同的細(xì)胞分開，分別將濾液中的細(xì)胞取出進(jìn)行培養(yǎng)，獲得同步細(xì)胞?！、巯跛崂w維素膜法（膜洗脫法）根據(jù)某些濾膜可吸附與該濾膜相反電荷細(xì)胞的原理，讓非同步細(xì)胞的懸液流經(jīng)此膜，于是一大群細(xì)胞被牢牢吸附。然后將濾膜翻轉(zhuǎn)并置于濾器中，其上慢速留下新鮮培養(yǎng)液，最初流出的是未吸附的細(xì)胞，不久，吸附的細(xì)胞開始分裂，在分裂后的兩個(gè)子細(xì)胞中一個(gè)仍吸附在濾膜上，另一個(gè)則被培養(yǎng)液洗脫。若濾膜足夠大，只要收集剛滴下的子細(xì)胞培養(yǎng)液即可獲得滿意的同步培養(yǎng)細(xì)胞。硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長(zhǎng)的方法同步生長(zhǎng)往往只能維持23個(gè)世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長(zhǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)，最后一次收獲；→分批培養(yǎng)（batch culture）或密閉培養(yǎng)（closed culture）→ 培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，不再更換。連續(xù)培養(yǎng)（Continous culture ）：又稱開放培養(yǎng)（open culture），在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過(guò)一定的方式使微生物能以恒定的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)并能持續(xù)生長(zhǎng)下去的一種培養(yǎng)方法。 重要特征：使微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)連續(xù)培養(yǎng)的類型按控制方式分：內(nèi)控制（控制菌體密度）恒濁器 外控制（控制培養(yǎng)液流速及R）：恒化器按培養(yǎng)器串聯(lián)級(jí)數(shù)分：?jiǎn)渭?jí)連續(xù)培養(yǎng)器 多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器按細(xì)胞狀態(tài)分：一般連續(xù)培養(yǎng)器 固定化連續(xù)培養(yǎng)器按用途分：實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器 發(fā)酵生產(chǎn)用：大型連續(xù)發(fā)酵罐在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中 ，通過(guò)控制培養(yǎng)液的流速保持不變，并使微生物始終在低于最高生長(zhǎng)速率的條件下生長(zhǎng)繁殖的連續(xù)培養(yǎng)裝置。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長(zhǎng)密度，并借光電控制系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高、生長(zhǎng)速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：①高效，簡(jiǎn)化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等許多單元操作，從而減少了非生產(chǎn)時(shí)間和提高了設(shè)備的利用率；②自控，即便于利用各種傳感器和儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；③產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；④節(jié)約了大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，使水、氣、電的負(fù)荷均衡合理。連續(xù)發(fā)酵的缺點(diǎn)：①菌種易退化—由于長(zhǎng)期讓微生物處于高速率的細(xì)胞分裂中，故即使其自發(fā)突變率極低，仍無(wú)法避免突變的發(fā)生，尤其當(dāng)發(fā)生比原生產(chǎn)菌株?duì)I養(yǎng)要求降低、生長(zhǎng)速率增高、代謝產(chǎn)物減少的負(fù)變菌株時(shí)；②易污染雜菌，在長(zhǎng)期的連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)中，存在著因設(shè)備滲漏、通氣過(guò)濾失靈等造成的污染；③營(yíng)養(yǎng)物的利用率一般低于單批培養(yǎng)。第四章　微生物的代謝與調(diào)節(jié)及其人工控制生物能的產(chǎn)生1底物水平磷酸化 物質(zhì)在生物氧化過(guò)程中，常生成一些含有高能鍵的化合物而這些化合物可直接偶聯(lián)ATP或GTP的合成。這種產(chǎn)生ATP等高能分子的方式稱為底物水平磷酸化底物水平磷酸化既存在于發(fā)酵過(guò)程中也存在于呼吸過(guò)程中。2氧化磷酸化 物質(zhì)在生物氧化過(guò)程中形成的NADH和FADH2可通過(guò)位于線粒體內(nèi)膜和細(xì)菌質(zhì)膜上的電子傳遞系統(tǒng)將電子傳遞給氧或其他氧化型物質(zhì)，在這個(gè)過(guò)程中偶聯(lián)著ATP的合成，這種產(chǎn)能方式稱為氧化磷酸化。在典型的呼吸鏈中，即電子通過(guò)典型的NAD+呼吸鏈傳遞時(shí)，只有三處能提供合成ATP所需要的足夠能量。因此，在2 [H] 從NADH2傳遞至O2的過(guò)程中，只有三處能與磷酸化反應(yīng)（ADP+Pi ATP）相偶聯(lián)，所以產(chǎn)生3分子ATP。電子通過(guò)FAD呼吸鏈傳遞時(shí)，因?yàn)橹挥卸幠芘cADP磷酸化相偶聯(lián)，故僅產(chǎn)生2分子ATP?？梢?，氧化磷酸化效率是NAD+呼吸鏈高于FAD呼吸鏈。這種關(guān)系用數(shù)量來(lái)表示稱為P/O比（即molATP/mol氧原子）。化學(xué)滲透偶聯(lián)學(xué)說(shuō) 由于ATP在生命活動(dòng)中所起的重要作用，闡明ATP合成的具體機(jī)制長(zhǎng)期以來(lái)一直是人們的研究熱點(diǎn)，至今能被許多學(xué)者認(rèn)可的是英國(guó)學(xué)者米切爾（)1961年提出1978年獲諾貝爾獎(jiǎng)的 化學(xué)滲透學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在氧化磷酸化