【正文】 胞膜外的細(xì)胞壁生長點(diǎn)處，必須通過一種稱作細(xì)菌萜醇的類脂載體的運(yùn)送。細(xì)菌萜醇是一種含11個異戊二烯單位的C55類異戊二烯醇，它可通過2個磷酸基與N乙酰胞壁酸分子相接，使糖的中間代謝物呈現(xiàn)出很強(qiáng)的疏水性，從而使它能順利通過疏水性很強(qiáng)的細(xì)胞膜而轉(zhuǎn)移到膜外。類脂載體除在細(xì)菌肽聚糖的合成中具有重要作用外，還可參與各類微生物多種胞外多糖和脂多糖的生物合成，包括細(xì)菌的磷壁酸、脂多糖，細(xì)菌和真菌的纖維素，以及真菌的幾丁質(zhì)和甘露聚糖等。（3）在細(xì)胞膜外的合成①多糖鏈的延長 從焦磷酸類脂載體上脫下來的肽聚糖單體，被運(yùn)到細(xì)胞膜外正在活躍合成肽聚糖的部位（細(xì)胞壁生長點(diǎn)），在那里必須有現(xiàn)成的細(xì)胞壁殘余（至少含有68個肽聚糖亞單位）作引物。（橫向連接）雙糖肽先是插入細(xì)胞壁生長點(diǎn)上作為引物的肽聚糖骨架中，通過轉(zhuǎn)糖基化作用使多糖鏈延伸一個雙糖單位。②通過轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽作用使相鄰多糖鏈交聯(lián)（縱向連接） 轉(zhuǎn)肽時先將D丙氨酰D丙氨酸間的肽鏈斷鏈，釋放一個D丙氨酰殘基，然后倒數(shù)第二個D丙氨酸的游離羧基與鄰接甘氨酸五肽的游離氨基形成肽鍵而實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。青霉素的結(jié)構(gòu)和D丙氨酰D丙氨酸的結(jié)構(gòu)相似，因而競爭轉(zhuǎn)肽酶的活力中心 。 當(dāng)轉(zhuǎn)肽酶與青霉素結(jié)合后，前后2個肽聚糖單體間不能形成肽橋，因此合成的肽聚糖是缺乏機(jī)械強(qiáng)度的“次品”，由此產(chǎn)生了原生質(zhì)體或球狀體之類的細(xì)胞壁缺損細(xì)菌，當(dāng)它們處于不利的環(huán)境下時，極易裂解死亡。青霉素的作用機(jī)制是 抑制肽聚糖分子中肽橋的生物合成，因此對處于生長旺盛繁殖階段的細(xì)菌具有明顯的抑制作用，相反，對于處于生長停滯狀態(tài)的休止細(xì)胞，卻無抑制作用。第五章 環(huán)境因子對微生物生長和代謝的影響1. 溫度 溫度通過影響膜的液晶結(jié)構(gòu)、酶和蛋白質(zhì)的合成及活性、RNA的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄等 影響微生物的生命活動。微生物的生長溫度范圍 應(yīng)該著重指出，最適生長溫度不一定是一切代謝活動的最好溫度 最低生長溫度 最高生長溫度 最適生長溫度 致死溫度對同一種微生物來說，其不同的生理生化過程有著不同的最適溫度。因此，最適生長溫度并不等于生長量最高時的培養(yǎng)溫度。也不等于發(fā)酵速度最高時的培養(yǎng)溫度或積累代謝產(chǎn)物量最高時的培養(yǎng)溫度，更不等于某一代謝產(chǎn)物量最高時的培養(yǎng)溫度。在較高溫度條件下，細(xì)胞分裂雖然較快，但維持時間不長，容易老化；而在較低溫度下，細(xì)胞分裂雖然較慢，但維持時間較長，結(jié)果細(xì)胞總產(chǎn)量反而較高。同樣，發(fā)酵速度與代謝產(chǎn)物積累量之間也有 對不同生理、代謝過程各有其相應(yīng)最適溫度的研究，有著重要的實(shí)踐意義。國外利用電子計(jì)算機(jī)對發(fā)酵溫度最佳點(diǎn)的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)在青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)時，各階段如采用變溫培養(yǎng)比在0 ℃下恒溫培養(yǎng)提高產(chǎn)量14%以上。 微生物的生長溫度類型 按照最適生長溫度范圍的不同分類①嗜冷微生物(低溫型）能在5℃以下生長的微生物稱為嗜冷微生物。種類 專性：最適溫度15℃，最高溫度20℃ 兼性：最適溫度25~30℃，最高溫度35℃左右 耐冷微生物 psychrotolerant 嗜冷微生物在低溫下生長的原因：⑴細(xì)胞膜含有大量的不飽和脂肪酸，使膜在低溫下也能保持半流動狀態(tài)；⑵細(xì)胞的酶在低溫下能有效地起催化作用，而在30~40℃的情況下，這些酶很快失活。 ②嗜溫微生物（中溫型）最適生長溫度在25~37℃微生物叫嗜溫微生物。 種類：寄生型（體溫型）：最適35~40℃腐生型（室溫型）：最適25~35℃。③ 嗜熱微生物（高溫型）嗜熱微生物：最適生長溫度50~60℃ 嗜高溫微生物：最適生長溫度在80℃以上 嗜熱微生物在高溫下生長的原因? 酶和其他蛋白質(zhì)中的更具有耐熱性；? 核酸中含有較多的GC對，對熱更加穩(wěn)定；? 細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量高，使膜具有熱穩(wěn)定性；? 細(xì)胞生長速率快，能迅速合成生物大分子，以彌補(bǔ)由于高溫造成的破壞。④嗜高溫微生物 已發(fā)現(xiàn)的嗜高溫微生物全都是古生細(xì)菌，它們所處的環(huán)境與普通細(xì)菌有很大區(qū)別。在高溫下生長的原因： 一般認(rèn)為它們蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)上存在的鹽橋數(shù)目增加（氨基酸帶上Na+或其它陽離子生成電荷橋）及蛋白質(zhì)高度密集的疏水內(nèi)部區(qū)域有關(guān)；它們細(xì)胞膜中不含脂肪酸，而是由植烷（不同長度碳?xì)浣M成的五碳重復(fù)單位化合物）組成，這和膜的熱穩(wěn)定性有關(guān)。 最適發(fā)酵溫度發(fā)酵速率和代謝產(chǎn)物積累速率最大時的溫度。極端溫度對微生物的影響極端溫度 低于最低生長溫度和高于最高生長溫度范圍的溫度。n 低溫： 停止生長n 冷凍：造成微生物細(xì)胞脫水及冰晶的機(jī)械損傷而引起微生物死亡。n 高溫：菌體蛋白變性，殺死細(xì)胞 定義 在相同的溫度和壓力下，體系中溶液的水蒸汽壓與純水的蒸汽壓之比：aw=p/p0水活度的決定因素：固體基質(zhì)：水被吸附的牢固程度 液體：溶質(zhì)的含量和溶質(zhì)的水合程度基質(zhì)水活度對微生物的影響 高水活度環(huán)境 低水活度環(huán)境干燥對微生物的影響 干燥使代謝停止，使微生物處于休眠狀態(tài)，嚴(yán)重時細(xì)胞脫水，蛋白質(zhì)變性，進(jìn) 而導(dǎo)致死亡。 應(yīng)用：保存物品，保藏菌種滲透壓對微生物的影響? 等滲溶液： 微生物正常生長? 低滲溶液： 細(xì)胞吸水膨脹，甚至脹破。? 高滲溶液 細(xì)胞脫水，影響代謝活動，引起質(zhì)壁分離，甚至死亡。好氧微生物aerobes 專性好氧菌 兼性厭氧菌 微好氧菌 厭氧微生物 anaerobes 耐氧厭氧菌 專性厭氧菌專性好氧菌 必須在高濃度分子氧的條件下才能生長的微生物 n Eh＞+ 可生長，最適在+~+ n 霉菌、大部分放線菌及部分細(xì)菌n 有完整的呼吸鏈，分子氧作為最終電子受體，氧參與合成固醇及不飽和脂肪酸；n 細(xì)胞含有超氧化物歧化酶和過氧化氫酶兼性厭氧菌 以在有氧的條件下生長為主，也可兼在厭氧條件下生長的微生物n Eh＞+ 通過好氧呼吸獲取能量 Eh＜+ 通過發(fā)酵或無氧呼吸獲取能量n 酵母和部分細(xì)菌n 細(xì)胞含有SOD和過氧化氫酶微好(嗜)氧菌只能在較低的氧分壓下才能正常生長；也通過有氧呼吸獲取能量。如：霍亂弧菌、氫單胞菌屬等耐氧厭氧菌：可在分子氧存在條件下進(jìn)行厭氧生活的厭氧菌。n 生長不需要氧，但分子氧對他們也無害n 僅依靠發(fā)酵或底物水平磷酸化獲得能量n 細(xì)胞內(nèi)有SOD和過氧化物酶，但無過氧化氫酶。 如：乳鏈球菌、乳酸乳桿菌、膜明串珠菌厭氧菌只能在無氧或低Eh(Eh+)值時, 才能生長。n 分子氧對細(xì)胞有毒n 通過發(fā)酵或無氧呼吸等獲取能量n 細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD、細(xì)胞色素氧化酶、大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶n 梭狀芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、 產(chǎn)甲烷菌厭氧菌的氧毒害機(jī)制：超氧化物歧化酶學(xué)說 超氧陰離子自由基是活性氧的形式之一，因有奇數(shù)電子，故帶負(fù)電荷；它既有分子性質(zhì)，又有離子性質(zhì)；其性質(zhì)極不穩(wěn)定，化學(xué)反應(yīng)力極強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)可破壞各種重要生物大分子和膜結(jié)構(gòu)，還可形成其他活性氧化物，故對生物體極其有害。 pH= lg[H+]環(huán)境pH對微生物的作用n 改變細(xì)胞膜所帶電荷狀態(tài)，從而影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；n 影響代謝過程中酶的活性；n 改變環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性；n 改變環(huán)境中有害物質(zhì)的毒性。微生物的生長pH范圍 不同微生物的生長pH范圍 微生物的類型（按最適生長pH范圍來分）n 嗜酸微生物 專性嗜酸菌： 最適pH＜6；pH＞7時生長極差或死亡。 兼性嗜酸菌：在低pH下生長，在中性pH也長。n 嗜堿微生物： 專性嗜堿菌：最適pH8~11，pH ≤7時生長極慢或不生長n 嗜中性微生物 能在pH4~9范圍內(nèi)生長，最適生長在pH6~8，大多數(shù)微生物屬于這一類。微生物的代謝對環(huán)境pH影響環(huán)境pH的控制直接加酸或堿進(jìn)行調(diào)節(jié)；加入酸性或堿性營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)和補(bǔ)充營養(yǎng)；加入緩沖性物質(zhì)微生物細(xì)胞內(nèi)的pH細(xì)胞內(nèi)部的pH值一般都接近中性：胞內(nèi)酶的最適pH多接近中性；細(xì)胞內(nèi)的DNA、ATP等對低pH敏感；RNA和磷脂類等對高pH敏感。 細(xì)胞膜上酶及胞外酶最適pH多接近微生物最適生長pH 滅菌 采用強(qiáng)烈的理化因素使物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。消毒 采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體或動、植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本無害的措施。滅菌和消毒方法高溫滅菌和消毒方法（1）干熱滅菌法 ①灼燒滅菌法 適用：接種工具， 污染物品，實(shí)驗(yàn)動物尸體等。②干熱滅菌法 適用：玻璃、陶瓷器皿，金屬用具等耐高溫的物品。（2）濕熱滅菌法 同樣溫度和相同作用時間下，濕熱滅菌比干熱滅菌效果好的原因 ①熱蒸汽穿透力強(qiáng)； ② 細(xì)胞物質(zhì)在含水量高時容易變性凝固； ③ 蒸汽凝固時釋放的大量蒸汽潛熱可迅速提高滅菌物品的溫度。 A. 常壓法①巴氏消毒法： 是一種專用于牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的液態(tài)風(fēng)味食品或調(diào)料的低溫消毒方法②煮沸消毒法：在100℃下煮沸數(shù)分鐘的方法，常用于飲用水的消毒③間歇滅菌法fractional sterilization：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌 不含營養(yǎng)物質(zhì)的物品不宜適用此法。 B. 加壓法①高壓蒸汽滅菌法（常規(guī)加壓蒸汽滅菌法）autoclaving ：是一種利用高溫進(jìn)行濕熱滅菌的方法。n 原理：在加壓條件下， 水的沸點(diǎn)超過100℃，由此可提供高于100℃的水蒸氣。n 對象：耐高溫物品，一般培養(yǎng)基，生理鹽水，緩沖溶液，玻璃、陶瓷器皿等n 控制：嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢制劑②連續(xù)加壓蒸汽滅菌法 適用于大型發(fā)酵廠的大批培養(yǎng)基滅菌 135~140℃下維持5~15秒 2．過濾除菌法：n 原理：將微生物過濾去除n 對象：空氣，熱敏物質(zhì)，蛋白質(zhì)，酶，血清，纖維素，氨基酸等n 注意：3．輻射滅菌（放射線滅菌法）n 原理：微波、紫外線、g射線、X射線的殺菌作用。g射線的穿透力非常強(qiáng)，可對密封包裝后的物品進(jìn)行滅菌。n 對象：不耐熱或受熱易變質(zhì)、變味的物品。 第六章 微生物菌種的篩選與保藏27 / 27生產(chǎn)菌株來源 索取或購買 自己選育(1) 用原有菌株進(jìn)行遺傳改造進(jìn)行育種 ①誘變育種 ②基因重組育種(2) 向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取、購買出發(fā)菌株進(jìn)行選育(3) 從自然界中分離菌種 從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需要的菌種。從自然界中分離篩選菌種的一般步驟設(shè)計(jì)方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離 →篩選(初篩、復(fù)篩)→單株純種分離→性能考察(生產(chǎn)性能試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、菌種鑒定）1. 采樣 從自然界中采集含目的菌的樣品采樣方法（1）去除表層土（2）取515cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或塑料袋中3．注意記錄：時間，地點(diǎn)，環(huán)境情況等樣品袋應(yīng)封好口，防止水分失去土樣應(yīng)在分離前破碎 盡快分離二. 增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制（1）控制營養(yǎng)成分* 多種微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2）控制培養(yǎng)基pH細(xì)菌、放線菌：中性偏堿，真菌：偏酸但非目的菌的生長不能被完全抑制（3）控制培養(yǎng)溫度（4）熱處理——增殖芽孢細(xì)菌 樣品懸浮液經(jīng)80℃、10分鐘處理，殺死營養(yǎng)體，再添加營養(yǎng)培養(yǎng)后可增殖產(chǎn)芽孢細(xì)菌（5）添加抑制劑三. 純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來獲得純培養(yǎng)1純種分離的一般方法（1）稀釋平板法 傾注平板或涂布平板（2）劃線法 （3）組織培養(yǎng)法 適用于分離高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇→切1小塊菌蓋→10%漂白粉消毒處理→無菌水沖洗→置瓊脂平板上→培養(yǎng)→長出菌絲體 或：→懸掛在有瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)→培養(yǎng)→長出菌絲體平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量（1）紙片培養(yǎng)顯色法216。 濾紙飽浸含有指示劑的液體培養(yǎng)基216。 用接種環(huán)接種216。 保濕恒溫培養(yǎng)216。 據(jù)菌落周圍變色圈和菌落直徑比值判別目的菌物產(chǎn)量（2）透明圈法 根據(jù)瓊脂培養(yǎng)上透明圈/菌落直徑大小判別目的產(chǎn)物的產(chǎn)量167。 淀粉平板透明圈：淀粉酶167。 碳酸鈣平板透明圈：產(chǎn)酸167。 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶（3）變色圈法216。 淀粉平板噴稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶216。 支鏈淀粉平板噴稀碘液：藍(lán)色圈：異淀粉酶 無色圈：液化型淀粉酶216。 葡聚糖平板加剛果紅：葡聚糖酶216。 木聚糖平板加剛果紅：木聚糖酶4）生長圈法167。 工具菌：216。 營養(yǎng)缺陷型，不能合成的物質(zhì)（生長因素）為目的菌積累的產(chǎn)物216。 菌落形態(tài)明顯不同于目的菌167。 方法：106~107 工具菌與樣品稀釋液一起涂布至瓊脂培養(yǎng)基表面，具有生長圈的菌落即為目的菌167。 適用：氨基酸，核苷酸，維生素產(chǎn)生菌的選育（5）抑制圈167。 適用：抗生素產(chǎn)生菌的選育167。 工具菌：對目的抗生素敏感的微生物例：目的菌為產(chǎn)生抗G+細(xì)菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黃色葡萄球菌167。 方法216。 目的菌分離：稀釋分離法，培養(yǎng)長出菌落216。 代謝物積累：用打孔器（6CM）將菌落連同周圍瓊脂培養(yǎng)基一起取下，放一無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，保濕培養(yǎng)45天，使新產(chǎn)生抗生素積累于小瓊脂塊中216。 測定：取107工具菌涂布于瓊脂培養(yǎng)基，將小瓊脂塊放于上面培養(yǎng)過夜，抑菌圈的出現(xiàn)，說明瓊脂塊中有抗生素，大小說明抗生素單位的高低厭氧性微生物的分離法（1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh167。 煮沸法：將培養(yǎng)基置沸水中煮沸15分鐘，驅(qū)除其中的溶解氧，勿再搖動， 以