【文章內(nèi)容簡介】 2KGA為底物。這些支路代謝都不利于2KGA的積累。對支路代謝的關(guān)鍵酶進(jìn)行基因敲除是提高2KGA產(chǎn)量和產(chǎn)率的比較有效的方法之一。為此，陳芳等[25]在tkrA基因插入鏈霉素抗性基因，用不穩(wěn)定型質(zhì)粒pBR322導(dǎo)入受體菌進(jìn)行同源重組得到敲除tkrA基因的重組菌株，由于同工酶基因tkrB的存在，直接的酶活檢測還無法進(jìn)行?；瘜W(xué)誘變也是弱少或阻斷支路代謝、提高2KGA產(chǎn)量的有效手段。Saito等[4]用MNNG (NmethylN’nitroNnitrosoguanidine , 甲基硝基亞硝基胍)對葡萄糖一步發(fā)酵生產(chǎn)2KGA的重組菌株進(jìn)行誘變，得到阻斷L艾杜糖酸代謝途徑的氧化葡萄糖酸桿菌突變株NB6939，使2KGA的產(chǎn)量達(dá)到31 mg/mL，比原菌提高約一倍。，提高2KGA的產(chǎn)量維生素C發(fā)酵過程中涉及多種含有輔因子的酶系，如SDH、L山梨酮脫氫酶(Lsobosone dehydrogenase, SNDH)、2,5二酮基D葡糖酸還原酶(2,5diketoDgluconic acid reductase, 2,5DKGR )、2酮基L古龍酸還原酶(2ketoLgulonic acid reductase, 2KGAR)等。其中SDH根據(jù)菌株不同可以用FAD[26]或P (Pyrroloquinoline Quinone，吡咯喹啉醌) [27]作為輔因子；G. melanogenus UV10中SNDH以NAD(P)為輔因子；Corynebacterium ATCC 31090中的2,5DKGR[28]和氧化葡萄糖酸桿菌中的2KGAR[29]都以NAD(P)H作為輔因子。調(diào)控胞內(nèi)輔因子的濃度、形式或改變酶對輔因子的利用偏好，可以有效的提高2KGA的產(chǎn)量，縮短發(fā)酵周期。以2,5二酮基D葡糖酸還原酶為例，棒狀桿菌中存在2,5DKGR A和B，其中2,5DKGRA既可以利用NADH也可以利用NADPH，但其與NADH解離常數(shù)約是與NADPH解離常數(shù)的260倍，更傾向于用NADPH作為輔因子。而胞內(nèi)NADH的濃度約為NADPH的3倍，且穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性較好。Sanli等對棒狀桿菌的2,5DKGRA進(jìn)行雙重位點(diǎn)突變得到2,5DKGRA(F22Y/A272G)與NADH的解離常數(shù)降低至原酶的1/3[30]。進(jìn)一步得到四重突變2,5DKGRA(F22Y/K232G/R238H/A272G)與NADH的解離常數(shù)進(jìn)一步降低至原酶的1/4[31]，大大降低了2,5DKGRA體外生產(chǎn)2KGA的成本。 混合培養(yǎng)兩菌關(guān)系對維生素C生產(chǎn)的影響以D山梨醇為底物的二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C是混合培養(yǎng)法生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的典型實(shí)例，其第二步發(fā)酵由產(chǎn)酸菌小菌和其伴生菌大菌混合發(fā)酵完成。小菌單獨(dú)培養(yǎng)困難且產(chǎn)酸能力很低；大菌單獨(dú)培養(yǎng)容易，不產(chǎn)2KGA，但可促進(jìn)小菌生長或產(chǎn)酸。能與小菌混合培養(yǎng)合成2KGA的伴生菌有很多，除常用的巨大芽孢桿菌外，還有蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等，某些酵母亦有該作用。大小菌之間是一種協(xié)同共生關(guān)系，即大菌促進(jìn)小菌生長和產(chǎn)酸，小菌也使大菌生長加快[13]。但細(xì)胞中合成2KGA 的酶活力與氧化葡萄糖酸桿菌的細(xì)胞量成正比，與巨大芽孢桿菌的細(xì)胞量多少無關(guān)。更進(jìn)一步研究表明，巨大芽孢桿菌在代謝過程中釋放出 3050 KDa[32]和100 KDa[33]的生物活性物質(zhì)參與氧化葡萄糖酸桿菌生長和產(chǎn)酸過程。這一胞外活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)。 染菌對維生素C生產(chǎn)穩(wěn)定性的影響影響維生素C發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的因素很多，其中噬菌體感染、玉米漿組分的穩(wěn)定性是最主要的影響因素。噬菌體感染是造成維生素C發(fā)酵異常的主要原因之一，常會導(dǎo)致生產(chǎn)延滯或產(chǎn)酸降低，甚至倒罐。目前，一種簡單有效的方法是篩選獲得抗噬菌體特性的優(yōu)良菌株。尹光琳[6]等采用紫外誘變、化學(xué)誘變和原生質(zhì)體融合等方法選育到一組抗染菌能力極強(qiáng)的新菌系氧化葡萄糖酸桿菌SCB329蘇云金芽孢桿菌SCB933，此菌系在多年的生產(chǎn)和試驗(yàn)中均未發(fā)生污染現(xiàn)象，使生產(chǎn)穩(wěn)定性提高，降低了生產(chǎn)成本。3 一步發(fā)酵工藝由于二步發(fā)酵過程中工藝復(fù)雜，影響因素較多，難以精確控制，同時3種微生物生長消耗了大量的原材料和能源。如能以D葡萄糖或D山梨醇為碳源進(jìn)行一步發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體2KGA，將是維生素C產(chǎn)業(yè)中革命性的進(jìn)步。目前，關(guān)于維生素C一步發(fā)酵工藝的研究主要集中在兩個方面：(1) 以D山梨醇為底物的二步發(fā)酵生產(chǎn)菌種為基礎(chǔ)構(gòu)建一步發(fā)酵菌株；(2) 以葡萄糖為底物的串聯(lián)工藝的菌株為基礎(chǔ)，構(gòu)建一步發(fā)酵菌株。研究發(fā)現(xiàn)，氧化葡萄糖酸桿菌T100以5%的山梨醇單獨(dú)發(fā)酵可以產(chǎn)生2KGA，但產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率很低， mg/%。而把此菌的SDH和SNDH基因在氧化葡萄糖酸桿菌G624中表達(dá)，用表達(dá)質(zhì)粒pSDH155構(gòu)建的重組菌株以5%的山梨醇為底物發(fā)酵的產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率分別提高到16 mg/mL和30%[4]。進(jìn)一步用化學(xué)誘變手段阻斷L艾杜糖途徑，用大腸桿菌的tufB1啟動子替換原有的啟動子，得到的重組菌株轉(zhuǎn)化10%山梨醇為2KGA的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率達(dá)到88 mg/%[34]。雖然D山梨醇一步發(fā)酵生產(chǎn)2KGA取得了很大進(jìn)展，但此方法還必須以葡萄糖通過高壓加氫制備山梨醇為原料，各國的科學(xué)家也在積極探索從葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生2KGA的途徑。Anderson等[28]人在歐文氏菌ATCC 21998中表達(dá)來源于棒狀桿菌ATCC 31090的2,5DKG還原酶基因，用表達(dá)質(zhì)粒ptrp135構(gòu)建的重組菌株在飽和的葡萄糖溶液中發(fā)酵得到1 mg/mL的2KGA。林紅雨等[35]把歐文氏菌和棒狀桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合， mg/mL。4 小結(jié)和展望分析現(xiàn)有的研究報道，盡管已對發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C前體2KGA生產(chǎn)菌的選育與改良、發(fā)酵過程的優(yōu)化控制等進(jìn)行了廣泛的研究，為了進(jìn)一步提高發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C的競爭力，今后的研究工作應(yīng)集中在：(1) 深入研究以D山梨醇為底物的二步發(fā)酵工藝中大小菌混合培養(yǎng)的關(guān)系，這是提高生物技術(shù)法生產(chǎn)維生素C的關(guān)鍵；(2) 生物技術(shù)法生產(chǎn)維生素C的關(guān)鍵酶的催化機(jī)制和調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究；(3) 對一步發(fā)酵菌株關(guān)于2KGA生產(chǎn)基因的表達(dá)系統(tǒng)繼續(xù)進(jìn)行深入的研究，找出影響發(fā)酵產(chǎn)率的關(guān)鍵因素。參考文獻(xiàn)(References)[1] Bremus C, Herrmann U, BringerMeyer S, et al. The Use of Microorganisms in LAscorbic Acid Production. Journal of Biotechnology,2006,124(1):196205.[2] Ji AG, Gao PJ. Synthesis of 2KetoLGulonic Acid from Gluconic Acid by CoImmobilized Gluconobacter Oxydans and Corynebacterium Sp. Biotechnology Letters,1998,20(10):939942.[3] Sugisawa T, Hoshino T, Masuda S, et al. MicrobialProduction of 2KetoLGulonic Acid from LSorbose and DSorbitol by GluconobacterMelanogenus. Agricultural and Biological Chemistry,1990,54(5):12011209.[4] Saito Y, Ishii Y, Hayashi H, et al. Cloning of Genes Coding for LSorbose and LSorbosone Dehydrogenases from Gluconobacter Oxydans and Microbial Production of 2KetoLGulonate, a Precursor of LAscorbic Acid, in a Rebinant