【文章內(nèi)容簡介】 的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細(xì)胞；保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物中的噬菌體效價(jià)（對噬菌體含量進(jìn)行計(jì)數(shù)）；以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒的感染效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制出病毒特征性的繁殖曲線； 有尾噬菌體：注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞1）通過尾部刺突固著于細(xì)胞；2）尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，使細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；3）尾鞘收縮，核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；λ噬菌體的的溶源性反應(yīng)：1）早期基因表達(dá)，產(chǎn)生gpcII，gpcro及gpcIII，后者可防止宿主的裂解酶對gpcII的降解。2）gpcII的積累促使阻遏蛋白cI的表達(dá)3）阻遏蛋白cI的積累導(dǎo)致噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的終止，形成原噬菌體。3） 早期表達(dá)的gpcro與cI的競爭最終確定λ噬菌體是進(jìn)入溶源狀態(tài)，還是進(jìn)入裂解循環(huán)。4） （ gpcro表達(dá)得早，但與基因組的結(jié)合能力較cI弱）5）阻遏蛋白cI的同樣可以抑制其它新侵入的λ噬菌體的表達(dá)，從而使溶源性細(xì)菌具有“免疫性”6）阻遏蛋白cI在一般情況下通過自身的轉(zhuǎn)錄激活保持低水平的表達(dá)，但有時(shí)種種原因轉(zhuǎn)錄水平下降，會(huì)偶爾導(dǎo)致溶源性噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)（105~10 2）。7）外界因素如紫外線可引起宿主的染色體的破壞，宿主產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)合成具有DNA重組活性的RecA蛋白，導(dǎo)致cI的被降解，噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。8）誘發(fā)裂解是檢查是否存在溶原性細(xì)菌的有效方法第八章遺傳型：是指生物所攜帶的全部遺傳因子及基因，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)；表型（表現(xiàn)型）：具有一定遺傳型的個(gè)體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。表型飾變：同樣遺傳型的生物，在不同的外界條件下，會(huì)呈現(xiàn)不同的表型，但這種表型的差異只與環(huán)境有關(guān)，表現(xiàn)為暫時(shí)性和不可遺傳性，并且表現(xiàn)為全部個(gè)體的行為！遺傳型變異（基因變異、基因突變）：由于環(huán)境因素等的影響，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致生物特性改變，與表型的飾變相比，這種變異是可以遺傳的，而由于遺傳物質(zhì)的變異的頻率一般很低，所以這種變異也常常表現(xiàn)為群體中極少數(shù)個(gè)體的行為（突變頻率通常106109）?；蚪M（genome）一個(gè)物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱。微生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：原核生物（細(xì)菌、古生菌）的基因組1）雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體），2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性，大腸桿菌和其它原核生物中基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計(jì)的基因數(shù)；一般不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。3）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)操縱子（operon）：功能相關(guān)的幾個(gè)基因前后相連，再加上一個(gè)共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點(diǎn)（啟動(dòng)子、操作子等）在基因轉(zhuǎn)錄時(shí)協(xié)同動(dòng)作。4）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝，5）.基因組的重復(fù)序列少而短；古生菌的基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細(xì)菌。但是信息傳遞系統(tǒng)(復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)則與細(xì)菌不同而類似于真核生物。具體內(nèi)容在微生物遺傳學(xué)中學(xué)習(xí)真核微生物（啤酒酵母）的基因組1）典型的染色體結(jié)構(gòu)106bp，分布在16條染色體中。象所有其它的真核細(xì)胞一樣，酵母菌的DNA也是與四種主要的組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)結(jié)合構(gòu)成染色質(zhì)(chromatin)的14bp核小體核心DNA；染色體DNA上有著絲粒(centromere)和端粒(telomere)，2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，3）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）和內(nèi)含子序列。而原核生物中非編碼區(qū)或內(nèi)含子均非常少，而人類基因組測序后發(fā)現(xiàn)了大量的非編碼區(qū)，被稱為基因組上的荒漠，估計(jì)只有510%用于編碼基因。4）重復(fù)序列多質(zhì)粒的檢測：a）　提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；b）　根據(jù)質(zhì)粒的分子大小和結(jié)構(gòu)特征，通過超速離心或瓊脂糖凝膠電泳可將質(zhì)粒與染色體DNA分開c）　對于常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點(diǎn)，如抗藥性初步判斷。（一般將菌點(diǎn)在相應(yīng)的抗性平板上，若抗性還在，證明質(zhì)?？赡苓€在，否則則可能質(zhì)粒已經(jīng)丟失，在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常采用這種方法對含質(zhì)粒的菌株進(jìn)行初步檢測）d）但這種方法并不保險(xiǎn)，因?yàn)橘|(zhì)?？赡軙?huì)整和到染色體上，或者細(xì)菌由于某種突變而產(chǎn)生抗藥性等。產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocin production plasmid）抗生素抑制或殺死近緣，甚至同種不同株的細(xì)菌較廣的抗菌譜通過核糖體直接合成的多肽類物質(zhì)一般是次級代謝產(chǎn)物編碼細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)的基因一般位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上一般無直接的結(jié)構(gòu)基因，相關(guān)酶的基因多在染色體上很多細(xì)菌能產(chǎn)生能抑制或殺死近緣。甚至同種不同株的細(xì)菌的因子（細(xì)菌蛋白），被稱為細(xì)菌素，以和抗生素相區(qū)別?？股匾话憔哂休^廣的抗菌譜。此外，抗生素一般是微生物的次級代謝產(chǎn)物（通過代謝過程而產(chǎn)生），而細(xì)菌素一般是直接通過核糖體直接合成的多肽類物質(zhì)。編碼細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因及涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)、及賦予宿主對該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，因此，細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名，例如大腸桿菌（E. coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。而枯草芽孢桿菌（B. subtilis）產(chǎn)生的細(xì)菌素被命名為subtilisin（枯草桿菌素）。等等。細(xì)菌素首先發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中，有多種col質(zhì)粒和產(chǎn)生多種colicins，其發(fā)揮作用的原理各不相同。例如，有的colicins從產(chǎn)生菌中釋放后，結(jié)合到敏感菌細(xì)胞膜特定的受體上，而該受體一般是負(fù)責(zé)一些重要物質(zhì)，如一些生長因子的運(yùn)輸?shù)模欢硗?，有些colicins則阻止一些重要的細(xì)胞功能的進(jìn)行。還有一些colicins則在細(xì)胞膜上形成通道，造成鉀離子和質(zhì)子的外泄，使細(xì)胞失去能化膜而不能產(chǎn)生能量。Colicin E2是一種DNA內(nèi)切酶，能切斷細(xì)胞DNA，而colicin E3是一種核酸酶，能在16SrRNA的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割從而使核糖體失活。由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)?；蚓幋a，有些甚至有商業(yè)價(jià)值，例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。誘變劑與致癌物質(zhì)——Ames試驗(yàn)原理：誘變劑的共性原則，即化學(xué)藥劑對細(xì)菌的誘變率與其對動(dòng)物的致癌性成正比：超過95%的致癌物質(zhì)對微生物有誘變作用；而90%以上的非致癌物質(zhì)對微生物沒有誘變作用利用細(xì)菌突變來檢測環(huán)境中存在的致癌物質(zhì)是一種簡便、快速、靈敏的方法?？梢酝ㄟ^某待測物質(zhì)對微生物的誘變能力間接判斷其致癌能力。該方法是由美國加利福尼亞大學(xué)的Ames教授首先發(fā)明，因此又稱Ames試驗(yàn)。該試驗(yàn)是利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his)的回復(fù)突變性能來進(jìn)行的。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)中外源DNA的三種后果1)進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子.2) 如果轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，其上的基因僅經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)，就成為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortive transduction），其特點(diǎn)是在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落。DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。3) 3）被降解, 轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗，在選擇平板上無菌落形成。(specialized transduction)溫和噬菌體感染受體菌后，其染色體會(huì)整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上，從而使宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化，例如λ噬菌體，其插入位點(diǎn)的二側(cè)分別是gal和bio基因；如果該溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因，（對λ噬菌體分別是gal和bio基因），會(huì)因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上，由此產(chǎn)生了一類特殊的噬菌體缺陷噬菌體，缺陷噬菌體除含大部分自身的DNA外，缺失的基因被幾個(gè)位于前噬菌體整合位點(diǎn)附近的宿主基因取代，這樣形成的雜合DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。但該缺陷噬菌體沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細(xì)胞后，通過DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：1）　被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中。而完全轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因；2）　局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同：1．　溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因，當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時(shí)，通過溶源轉(zhuǎn)變而獲得的形狀也同時(shí)消失2．　這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的；枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化模型：a）　細(xì)菌生長在一定的培養(yǎng)條件下生長到一定階段，以枯草芽孢桿菌為例是在葡萄糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長末期到穩(wěn)定期，細(xì)胞向胞外分泌一種小分子的蛋白質(zhì)，稱為感受態(tài)因子，其分子量為5000到10000道爾頓。b）　當(dāng)培養(yǎng)液中的感受態(tài)因子積累到一定濃度后，與細(xì)胞表面受體相互作用，通過一系列信號傳遞系統(tǒng)誘導(dǎo)一些感受態(tài)一特異蛋白質(zhì)(petence specific protein)表達(dá)，其中一種是自溶素(autolysin)，它的表達(dá)使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與DNA結(jié)合的活性。 c）　DNA以雙鏈形式在細(xì)胞表面的幾個(gè)位點(diǎn)上結(jié)合并遭到核酸酶的切割，核酸內(nèi)切酶首先切斷DNA雙鏈中的一條鏈，被切斷的鏈遭到核酸酶降解，成為寡核苷酸釋放到培養(yǎng)基中，另一條鏈與感受態(tài)一特異蛋白質(zhì)結(jié)合，并被引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，d）　進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過同源重組以置換的方式整合進(jìn)受體染色體DNA，經(jīng)復(fù)制和細(xì)胞分裂后形成重組體?？莶菅挎邨U菌的自然轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)：1）　枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌細(xì)胞對雙鏈DNA的吸附和攝取是沒有特異性的，轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系，關(guān)系越近，則DNA之間的同源性也越高，就越容易在DNA之間發(fā)生重組，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。2）　自然感受態(tài)除了對線型染色體DNA分子的攝取外，也能攝取質(zhì)粒DNA，但在通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多，這是因?yàn)橘|(zhì)粒作為細(xì)菌染色體外獨(dú)立存在的遺傳物質(zhì)和染色體DNA同源性很差（否則會(huì)因?yàn)楹腿旧wDNA之間的重組而不穩(wěn)定），這樣被切割成單鏈后進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒DNA將很難通過重組重新恢復(fù)成有活性的狀態(tài)（雙鏈閉合環(huán)狀），或通過整合進(jìn)染色體而使相關(guān)性狀得到表達(dá)；如要提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率，可以用二種方法：i）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有活性的質(zhì)粒的幾率大大提高；ii）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌重組獲救。3）　噬菌體DNA也可被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒，這個(gè)過程被稱為轉(zhuǎn)染(transfection)，其特點(diǎn)是提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非病毒感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆?！，F(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染。主要有如下幾個(gè)因素會(huì)對微生物菌種的穩(wěn)定性造成影響：1． 變異：即通過變異而失去重要的遺傳特性，例如發(fā)酵生產(chǎn)能力下降，或研究中所需要的營養(yǎng)缺陷型由于回復(fù)突變等而改變2． 污染：由于微生物在自然界中種類多，分布廣，空氣、桌面、皮膚表面都有大量的各種微生物存在，因此在進(jìn)行微生物菌種操作（包括接種、培養(yǎng)等）時(shí)非常容易污染，從而造成菌種的丟失。3． 死亡：微生物容易在實(shí)驗(yàn)室里用人工配制的各種培養(yǎng)基培養(yǎng)，但如果超過時(shí)間不轉(zhuǎn)接菌種，由于疏忽培養(yǎng)條件發(fā)生改變，及其它各種以外情況（如冰箱停電）都容易造成菌種的死亡。而且這種損失有時(shí)是不可挽回的。菌種保藏：在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂 第九章目前常用的三種體外DNA連接方法為：① DNA連接酶可連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段；② 用T4 DNA連接酶連接具有平末端的DNA片段；③ 先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然后再行連接。④ 將粘性末端補(bǔ)平或修平（用單鏈酶，如綠豆芽核酸酶）連接柯斯質(zhì)粒用于克隆大片段的DNA分子特別有效，而這種特性對于研究高等生物的基因組十分重要。其特點(diǎn)：1）具有λ噬菌體的特性：在克隆了外源片段后可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對λ噬菌體敏感的大腸桿菌細(xì)胞。進(jìn)入寄主的柯斯質(zhì)粒DNA分子，按照λ噬菌體DNA的方式環(huán)化， 但無法按噬菌體的方式生活，更無法形成子代噬菌體顆粒。2）具有質(zhì)粒載體的特性：在寄主細(xì)胞內(nèi)如質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，攜帶有抗性基因和克隆位點(diǎn)，并具氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)。3）具有高容量的克隆能力：柯斯質(zhì)粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的極限值竟高達(dá)45kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過質(zhì)粒載體及λ噬菌體載體的克隆能力。同時(shí)，由于包裝限制，柯斯質(zhì) 粒載體的克隆能力還存在一個(gè)最低極限值。例如， 5 kb大小的 柯斯質(zhì)粒載體，插入的外源片段至少不能小于30 kb。 M13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀ssDNA，大小為6407bp。其生活史為：1）通過性毛感染雄性（F+或Hfr）大腸桿菌，或通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入雌性大腸桿菌細(xì)胞；2）進(jìn)入細(xì)胞后，轉(zhuǎn)變成復(fù)制型 (RF) dsDNA，然后以滾環(huán)方式制出ssDNA。每當(dāng)復(fù)制出單位長度正鏈，即被切出和環(huán)化，并被立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式（即宿主細(xì)胞不被裂解）被釋放至胞外。M13克隆載體是對野生型M13進(jìn)行改造后建成，其特點(diǎn)是雖然克隆外源DNA的能力較小，一般只適于克隆300～400bp的外源DNA片段，但特別適合用于制備克隆基因的單鏈DNA。主要被用于制備測序用單鏈DNA模板、特異的單鏈DNA探針，進(jìn)行定位誘變等，也可用于噬菌體展示（phage display第十章　 微生物的生態(tài)有關(guān)基本概念：生態(tài)系統(tǒng)：在一定的空間內(nèi)生物的成分和非生物的成分通過物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)互相作用、互相依存而構(gòu)成的一個(gè)生態(tài)學(xué)功能單位。生態(tài)學(xué)：研究生物與其周圍生物和非生物環(huán)境之間相互關(guān)系微生物生態(tài)學(xué)：研究微生物與其周