【文章內(nèi)容簡介】 6。00′E；30176。40′ N，124176。00′E設(shè)置2個(gè)站點(diǎn)，共計(jì)設(shè)置調(diào)查站位24個(gè)。樣品采集時(shí)間為2008年秋季。樣品暫放于4℃冰箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室。帶回實(shí)驗(yàn)室后立即準(zhǔn)備后續(xù)的海洋懸浮物的微生物培養(yǎng)工作。具體采樣地點(diǎn)如圖1。30311211221231241251 圖1 樣品采樣的地點(diǎn)說明：我們這次的調(diào)查范圍是在靠近長江口的杭州灣附近，是在1這個(gè)點(diǎn)位采集的樣品帶回來進(jìn)行研究的。:(1)配制100ml的TE溶液:10Mm TrisHCl；1mM EDTA(pH=8)；1ml Tris母液。,高壓滅菌4℃保存?zhèn)溆谩?2)抽提液I 酚:氯仿:異戊醇=25:24:1(盛與棕色瓶)(3)抽提液II 氯仿:異戊醇=24:1(盛與棕色瓶)(4)70%乙醇(5)100%異丙醇（6）10%SDS溶液（7）蛋白酶K3（8）Nacl溶液（9）CTAB/ NaCl溶液（10）異丙醇海爾冰箱 BCD196F青島海爾股份有限公司 ；FEB78型雙向磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHG9053A型 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQSG46280S 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SWCJ2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZF6型三用紫外線分析儀 上海嘉鵬科技有限公司；BIORAD電泳槽 PowerPac Basic 041BR 38252；SHZA水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK8B型 電熱恒溫水槽 上海華連醫(yī)療器械有限公司；EPPENDORF PCR儀 5341 0605679；EPPENDORF 離心機(jī)3417R 5407 0022202；格蘭仕微波爐 P70D17TLD5 佛山市順德區(qū)微爐有限公司；電子天平BS124S 40960483 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司； 提取DNA的步驟我們采集到的微生物沒有進(jìn)行培養(yǎng)，直接進(jìn)行微生物鑒定實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)是采用傳統(tǒng)的方法即酚、氯仿法。傳統(tǒng)法是目前最常用最可靠的DNA提取方法,所需費(fèi)用低,所提取的DNA可滿足臨床各種檢測需要，但操作繁瑣,耗時(shí)長,DNA損失量大,產(chǎn)率低,且有污染和毒性作用，傳統(tǒng)法適用于初學(xué)者或經(jīng)費(fèi)有限的實(shí)驗(yàn)室。具體步驟如下：（1） 把溶液放進(jìn)離心機(jī)中離心，然后移去上清液，得到沉淀物質(zhì)。（2）加入567ulTE溶液重懸（3）加入10%SDS 30μl和20mg/ml蛋白酶K3μl,于37℃溫育1h（4）加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,4℃12000g/min離心5min。（5）將上清液轉(zhuǎn)入另1個(gè)離心管中加等體積的酚/氯仿/異戊醇,混勻,4℃12000g/min離心5min（6）提取上清置于另一管中,輕柔混合,4℃12000g/min離心5min（7）棄上清,加入70%乙醇洗滌1min,離心,棄上清（8）將沉淀的DNA溶于100μl的無菌去離子水中,20℃保存?zhèn)溆眉?xì)菌離心（12000g/min,4min）,10%的SDS去破壁,蛋白酶K3溶解蛋白,CTAB/NaCl溶液去多糖,氯仿/異戊醇和酚/氯仿/異戊醇抽提,異丙醇沉淀DNA,最后以70 %乙醇溶解。．用電泳檢測DNAA．洗凈玻璃板或塑料盤并干燥備用，調(diào)節(jié)電泳槽底腳螺絲使其水平,在塑料盤兩側(cè)放置擋板。B．根據(jù)擴(kuò)增片段大小所需濃度,準(zhǔn)確稱量瓊脂糖于三角瓶中,加入50ml 1TbE電泳緩沖液。緩沖液不要超過三角瓶的50%。C．在三角瓶上蓋上錫箔紙,用微波爐或在沸水上加熱至瓊脂糖溶解,然后使溶液冷卻至60℃,此時(shí)膠濃度為1%,(EB)溶液(用蒸餾水配制),充分混勻(注意EB有毒,強(qiáng)誘變劑,有致癌作用,操作時(shí)務(wù)必戴上手套,小心操作)。D．用加樣槍吸取少量溶液封住檔板邊緣。–。E．將剩余的溶液倒入塑料盤中。凝膠厚度為35mm,用槍頭將溶液中的氣泡排掉。F．凝膠完全凝固(約需3040min)后,小心拔去梳子,將塑料盤及凝膠一起放入電泳槽中,加入恰好沒過膠面1mm的1TBE,準(zhǔn)備點(diǎn)樣。DNA Loading buffer(含有溴酚藍(lán)和甘油等物質(zhì))以5：1比值混合后，用微量槍慢慢將混合物加至樣品槽中，最邊上的孔加Marber23ul對照。，使DNA向陽極移動，采用電壓為80～100V。，取出玻璃板，在紫外燈下觀查凝膠。：溴化乙錠是熒光染料，該物質(zhì)含有一個(gè)特殊的堿基，會導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，由于結(jié)合了染色劑的DNA和其它物質(zhì)所發(fā)出的熒光屬于不同的發(fā)光段，因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測到少量的DNA。 PCR擴(kuò)增檢測（1）PCR引物:根據(jù)細(xì)菌特有的高度保守序列16srDNA，設(shè)計(jì)合成了一對引物：27F 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′1492r 5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′(2)PCR反應(yīng)體系（50ul）：PCR反應(yīng)的基本成分包括:模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液其中模板DNA（提出的細(xì)菌DNA）8ul；其他的基本成分如下表1所示：反應(yīng)成分儲備液濃度終濃度工作液配制Reaction ComponentsStock Solution Concentration Final ConcentrationWorking Solution PreparationddH2O29ulPCR Buffer10*PCR Buffer1*PCR Buffer5ulDNTPs25mmol/l2mmol/l4ul引物1引物2Taq酶終體積50ul說明：10Buffer是提取緩沖液；dNTP是四種脫氧核苷三磷酸；Taq酶是DNA聚合酶（3）PCR擴(kuò)增條件:PCR擴(kuò)增是通過變性(denaturation)、退火(annealing)和延伸(extension)三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)來實(shí)現(xiàn)的。因此,確定正確的PCR反應(yīng)程序參數(shù)是PCR成功的保證。熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：預(yù)變性95oC5min；95oC變性1min；53oC退火1min；，進(jìn)行了30個(gè)循環(huán)；72oC延伸10min；4oC保存。具體反應(yīng)程序如表2.Step1預(yù)變性：95℃5minStep2變性：95℃1minStep3退火：53℃1minStep4延伸：72℃Step524步驟，30個(gè)循環(huán)Step6延伸：72℃10minStep7保溫：4℃112hStep8結(jié)束PCR技術(shù)十分靈敏，少數(shù)幾個(gè)模板分子就可以檢查出來。它的括增效率非常高，通?？梢岳ㄔ?06倍。其擴(kuò)增產(chǎn)量可以按下列公式計(jì)算：y =(1+x)ny=產(chǎn)量 x=擴(kuò)增效率 n=循環(huán)次數(shù)PCR反應(yīng)在EPPENDORF PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)脫鹽純化后,%瓊脂糖凝膠電泳檢測，點(diǎn)樣量為3μl。（盡量切除多余的部分）,然后把條帶放入離心管中，稱取重量。，然后在50℃的水浴中放置10min。期間不斷上下翻轉(zhuǎn)離心管，使膠塊完全溶解。溶解完全后放置在常溫下23min。，3，000rpm離心30s，重復(fù)一次，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。，然后重復(fù)一次步驟3的操作。，13，000rpm離心30s，倒掉廢液。將離心吸附柱放回收集管中，13，000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步實(shí)驗(yàn)。（影響回收率和DNA質(zhì)量），向吸附膜中間位置懸空滴加25mlddH20，室溫放置2min。13，000rpm離心1min收集DNA溶液。，