基于分子生物學的長江口外海域中微生物鑒定-wenkub
2023-04-19 23:18:14 本頁面
【正文】 產(chǎn)熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 電源電壓 在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。關(guān)鍵詞： 海洋微生物，種類鑒定，16SrRNA，海洋懸浮物 Identifications of Microorganism from the Outside waters of Changjiang River Estuary by Molecular Biology TechniquesAbstract: Being as a major part of Satellite Ocean Center of China , this study is trying to primarily investigate the microorganism species in the Suspended solids from the Outside waters of Changjiang River Estuary。基于分子生物學的長江口外海域中微生物鑒定摘要：作為國家衛(wèi)星海洋中心組成部分，本論文主要是初步查明秋季長江口外海域海洋懸浮物中的微生物種類。 In fall in 2008, we collected Suspended solids samples from the biology investigation spot 24 of Satellite Ocean Center of China, then identified the marine microorganism species by using direct amplifications of 16S rRNA gene from marine microorganism, cloning and sequencing techniques. In this study, we hope to identify the marine organism species in sediment from the China East Sea near to Shanghai, which could provide basis for the establishments of marine microorganism molecular detection technique system.Key words: Marine microorganism, species identification, 16SrRNA, marine sediments基于分子生物學的長江口外海域中微生物鑒定DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。 對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA ()和Tris乙酸],TBE(Tris硼酸和EDTA),TPE(Tris磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫.三、 瓊脂糖凝膠的制備 取5TBE緩沖液20ml加水至200ml,TBE稀釋緩沖液,待用。 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。 表型鑒定法它是對前3個水平的鑒定,包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學分類鑒定法。微生物數(shù)值分類鑒定集數(shù)學、電子、信息及自動分析技術(shù)于一體,具有系統(tǒng)化、標準化、微量化和簡易化等優(yōu)點,采用商品化的鑒定測試卡,將未知菌鑒定到屬、種、亞種或生物型,可對不同來源的臨床標本進行針對性鑒定,所得結(jié)果以數(shù)字方式表達,與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(手冊或軟件)對比得出鑒定結(jié)果。下面我們主要對16SrRNA序列分析進行詳細介紹。60年代末,Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類,他通過比較各類生物細胞的核糖體RNA(rRNA)特征序列,認為16SrRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。16SrRNA的相對分子量適中,作為研究對象較理想。rRNA結(jié)構(gòu)既具有保守性,又具有高變性。rRNA在細胞中含量大,一個典型的細菌中含有10000～20000個核糖體,易于提取,可以獲得足夠的使用量供比較研究之用。通過比較各類生物16SrRNA的基因序列,從序列差異計算它們之間的進化距離,可以繪出生物進化樹。另一種選擇是提取微生物細胞中的核糖體RNA。由于PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展,現(xiàn)在一般采用16SrRNA引物PCR擴增總DNA中的rRNA序列,或通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得CrDNA序列后再進行分析。二是通過16SrRNA種屬特異性的探針與PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。環(huán)境樣品中的微生物DNA提取物通常是不同微生物的DNA混合物,經(jīng)過PCR后,其產(chǎn)物是序列等長但不同源DNA片段的混合物。DGGE的原理是:在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度,DNA雙鏈一旦解鏈,其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降。盡管DGGE凝膠上的條帶可以在回收后用于測序,以便進行更詳盡的微生物分類分析,但研究者一般僅利用DGGE等技術(shù)進行微生物群落的初步分析,而用建立細菌16SrDNA文庫的方法進行更為深入的分析。研究表明,400～600堿基的序列足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計,但這樣短的序列通常不能用于新物種鑒定和探針設計。計算菌屬、菌種之間的遺傳距離可以采用不同方法,如JukesCantor方法。30′124176。00′E間設置12個調(diào)查站位；另外在30176。00′E設置2個站點，共計設置調(diào)查站位24個。具體采樣地點如圖1。(2)抽提液I 酚:氯仿:異戊醇=25:24:1(盛與棕色瓶)(3)抽提液II 氯仿:異戊醇=24:1(盛與棕色瓶)(4)70%乙醇(5)100%異丙醇（6）10%SDS溶液（7）蛋白酶K3（8）Nacl溶液（9）CTAB/ NaCl溶液（10）異丙醇海爾冰箱 BCD196F青島海爾股份有限公司 ；FEB78型雙向磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；DHG9053A型 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQSG46280S 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SWCJ2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；ZF6型三用紫外線分析儀 上海嘉鵬科技有限公司；BIORAD電泳槽 PowerPac Basic 041BR 38252；SHZA水浴恒溫振蕩器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DK8B型 電熱恒溫水槽 上海華連醫(yī)療器械有限公司；EPPENDORF PCR儀 5341 0605679；EPPENDORF 離心機3417R 5407 0022202；格蘭仕微波爐 P70D17TLD5 佛山市順德區(qū)微爐有限公司；電子天平BS124S 40960483 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司； 提取DNA的步驟我們采集到的微生物沒有進行培養(yǎng)，直接進行微生物鑒定實驗。（2）加入567ulTE溶液重懸（3）加入10%SDS 30μl和20mg/ml蛋白酶K3μl,于37℃溫育1h（4）加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,4℃12000g/min離心5min。緩沖液不要超過三角瓶的50%。E．將剩余的溶液倒入塑料盤中。，使DNA向陽極移動，采用電壓為80～100V。因此,確定正確的PCR反應程序參數(shù)是PCR成功的保證。其擴增產(chǎn)量可以按下列公式計算：y =(1+x)ny=產(chǎn)量 x=擴增效率 n=循環(huán)次數(shù)PCR反應在EPPENDORF PCR儀上進行。期間不斷上下翻轉(zhuǎn)離心管，使膠塊完全溶解。，13，000rpm離心30s，倒掉廢液。13，000rpm離心1min收集DNA溶液。%瓊脂糖凝膠電泳檢測。調(diào)節(jié)電泳槽底腳螺絲使其水平,在塑料盤兩側(cè)放置擋板。–。DNA Loading buffer(
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