【文章內(nèi)容簡介】 氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。 核酸雜交技術(shù)（一）Southern Blot原理：將待檢測的DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途：檢測DNA樣品中的基因及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。 （二）Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。用途：檢測RNA樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 RNA 干擾RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi的基本原理RNAi具有特異性和高效性。是一個依賴ATP的過程，一種稱為Dicer的核酸酶負責將dsRNA酶切轉(zhuǎn)化為3’端有2～3nt突出、長21～23bp 的小分子雙鏈RNA ，這種RNA稱為小干擾RNA（siRNA）。siRNA形成之后，與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導干擾復合體(RISC)，此復合物通過堿基互補配對識別靶mRNA 并使其降解，從而導致特定基因沉默?；蚪M（genome）基因組（genome）一詞系由德國漢堡大學H. Winkles 教授于1920年首創(chuàng)，從GENe和chromosOME組成。用于表示生物的全部基因和染色體組成的概念。基因組（genome）：生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)的總和。遺傳圖與物理圖 遺傳作圖（Genetic mapping） 采用遺傳學分析方法將基因或其它DNA順序標定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分析等。物理作圖（Physical mapping） 采用分子生物學技術(shù)直接將DNA分子標記、基因或克隆標定在基因組實際位置。常用的物理作圖方法： 由于遺傳圖的以上局限，須用物理圖對其進行驗證，校正和補充。 限制性作圖（Restriction mapping）  熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）作圖 順序標簽位點（Sequence tagged site, STS）作圖 各種作圖法比較 限制性作圖快速，可提供詳細信息，但不適合大基因組。 熒光原位雜交操作困難，資料積累慢，一次實驗定位的分子標記不超過34個。 繪制詳細的物理圖還須尋找更有效方法。序列標記位點（STS）作圖 目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大基因組作出最詳盡圖譜的技術(shù)。 序列標記位點(STS)是一段短的DNA序列，通常長度在100到500bp，易于識別，每個基因組僅一份拷貝 。 作圖時，先獲取來自完整基因組的DNA片段。使用PCR技術(shù)檢驗DNA片段中的STS。兩個STS共存于同一片段的概率依賴于它們在基因組中的接近程度。據(jù)此可計算兩個STS間的距離一個DNA序列要成為STS，須滿足兩個前提： 1）首先它的序列必須是己知的，以便于用PCR方法檢測STS在不同DNA片段中存在與否。 2）第二個要求是STS必須在待研究的染色體上有惟一的定位。如果STS序列具有多個 定位點，那么作圖數(shù)據(jù)將會模糊不清。因此要確保STS不包含重復DNA序列。最常見的來源是： 1）表達序列標簽（EST）：是從cDNA克隆中獲得的短序列。須來自單拷貝基因而非基因家族成員。 2）簡單序列長度多態(tài)性： SSLP在作圖中可被用作STS，具有多態(tài)性并已通過連鎖分析定位，直接建立遺傳圖與物理圖的聯(lián)系。 3）隨機基因組序列 可以通過對克隆的基因組DNA的隨機小片段進行測序或在數(shù)據(jù)庫中搜尋貯存序列獲得STS。 第7章　基因的表達與調(diào)控（上）——原核基因表達調(diào)控模式 基因表達調(diào)控的基本概念基因表達與基因表達調(diào)控、組成型表達和適應(yīng)型表達、調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因、操縱子一、基因表達與基因表達調(diào)控概念基因表達（gene expression） ：細胞在生命過程中，把蘊藏在DNA中的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成為蛋白質(zhì)或功能RNA分子的過程稱為基因表達。 圍繞基因表達過程中發(fā)生的各種各樣的調(diào)節(jié)方式都統(tǒng)稱為基因表達調(diào)控。rRNA或tRNA的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生成熟的rRNA或tRNA,也是rRNA或tRNA的基因表達，因為rRNA或tRNA就具有在蛋白質(zhì)翻譯方面的功能。 二、基因表達的方式：組成型表達及適應(yīng)型表達１、組成型表達(constitutive expression) ：指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達。如ＤＮＡ聚合酶，ＲＮＡ聚合酶等代謝過程中十分必需的酶或蛋白質(zhì)的表達。某些基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(housekeeping gene)。管家基因無論表達水平高低，較少受到環(huán)境因素的影響。在基因表達研究中，常作為對照基因２、適應(yīng)型表達（adaptive expression)：指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達水平增高或從無到有的現(xiàn)象稱為誘導(induction)，這類基因被稱為可誘導的基因(inducible gene)；相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低或變?yōu)椴槐磉_的現(xiàn)象稱為阻遏(repression)，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因(repressible gene)。三、結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因（structural genes）：編碼蛋白質(zhì)或功能性RNA的任何基因。所編碼的蛋白質(zhì)主要是組成細胞和組織基本成分的結(jié)構(gòu)蛋白、具有催化活性的酶和調(diào)節(jié)蛋白等。原核生物的結(jié)構(gòu)基因一般成簇排列，真核生物獨立存在。結(jié)構(gòu)基因簇由單一啟動子共同調(diào)控。調(diào)節(jié)基因（regulator genes）：參與其他基因表達調(diào)控的RNA或蛋白質(zhì)的編碼基因。216。 調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)物質(zhì)通過與DNA上的特定位點結(jié)合控制轉(zhuǎn)錄是調(diào)控的關(guān)鍵。216。 調(diào)節(jié)物與DNA特定位點的相互作用能以正調(diào)控的方式（啟動或增強基因表達活性）調(diào)節(jié)靶基因，也能以負調(diào)控的方式（關(guān)閉或降低基因表達活性）調(diào)節(jié)靶基因。操縱子：由操縱基因以及相鄰的若干結(jié)構(gòu)基因所組成的功能單位，其中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄受操縱基因的控制。　原核基因調(diào)控的分類和主要特點一、原核生物的基因調(diào)控特點：（1）基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，形式主要是操縱子調(diào)控.（2）有時也從DNA水平對基因表達進行調(diào)控，實質(zhì)是基因重排。（3）在原核生物中，也有控制翻譯過程的調(diào)控機制。（4）原核生物轉(zhuǎn)錄的起始、延伸、終止和抗終止過程及翻譯的起始、延伸和終止過程，每一步都在對基因的表達實行調(diào)控。 二、原核生物基因調(diào)控的分類根據(jù)調(diào)控機制的不同可分為：正轉(zhuǎn)錄調(diào)控和負轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩大類根據(jù)基因?qū)δ承┠苷{(diào)節(jié)它們的小分子的應(yīng)答，可分為可誘導調(diào)節(jié)和可阻遏調(diào)節(jié)兩大類。正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)和負轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)在負轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)其作用特征又可分為負控誘導和負控阻遏二大類。在負控誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物（誘導物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（輔阻遏物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白作用的部位是操縱區(qū)l 在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）,促進結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。也可根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為正控誘導系統(tǒng)和正控阻遏系統(tǒng)。l 在正控誘導系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；l 在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（輔阻遏蛋物）的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。 細菌的應(yīng)急反應(yīng)細菌有時會碰到緊急狀況，比如氨基酸饑餓時，就不是缺少二種氨基酸，而是氨基酸的全面匱乏。為了緊縮開支，渡過難關(guān)，細菌將會產(chǎn)生一個應(yīng)急反應(yīng)，包括生產(chǎn)各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學反應(yīng)過程均被停止。實施這一應(yīng)急反應(yīng)的信號是鳥苷四磷酸（ppGpp）和鳥苷五磷酸（pppGpp）。產(chǎn)生這兩種物質(zhì)的誘導物是空載tRNA。關(guān)于ppGpp的作用原理還不大清。ppGpp與pppGpp的作用范圍十分廣泛，它們不是只影響一個或幾個操縱子，而是影響一大批，所以它們是超級調(diào)控因子。 乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O，一個啟動子P和一個調(diào)節(jié)基因I。乳糖操縱子同時受正性調(diào)節(jié)和負性調(diào)節(jié)。①阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)：沒有誘導物存在時，I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有誘導物存在時，誘導物誘導阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機制為可誘導的負調(diào)控。②CAP的正性調(diào)節(jié)：在啟動子上游有CAP結(jié)合位點，當大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結(jié)合位點，激活RNA聚合酶活性，促進結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，對乳糖操縱子實行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。因此，乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。 lac操縱子的激活需要cAMP－CRP（CAP）復合物。這種需要是獨立的，與阻遏體系無關(guān)，轉(zhuǎn)錄必須有此復合物在ＤＮＡ的啟動子區(qū)域。lac操縱子的功能是在這兩個體系的共同作用下來實現(xiàn)的.： 阻遏物的負調(diào)控因子、 CAP的正調(diào)控因子lac操縱子的誘導劑乳糖并不與阻遏物相結(jié)合，真正的誘導物是乳糖的異構(gòu)體異構(gòu)乳糖。 Lac操縱子的誘導物 (inducer)：異構(gòu)乳糖（別乳糖）、半乳糖、IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）非底物誘導物(gratuitous inducer)：既能誘導酶的產(chǎn)生而本身又不被分解的誘導物。葡萄糖對lac操縱子的影響 ——代謝物阻遏效應(yīng)catabolite repression 葡萄糖效應(yīng)：是指當葡萄糖和其它糖類一起作為細菌的碳源時葡萄糖總是優(yōu)先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖類的利用的現(xiàn)象。除葡萄糖外，阿拉伯糖、麥芽糖等在降解過程中均轉(zhuǎn)化生成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產(chǎn)物，所以，這些糖代謝中有關(guān)的酶都是由可誘導的操縱子控制的。只要有葡萄糖存在，這些操縱子就不表達，被稱為降解物敏感型操縱子。降解物敏感型操縱子：包括代謝乳糖、阿拉伯糖及麥芽糖等的操縱子。 色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)：色氨酸操縱子中的結(jié)構(gòu)基因區(qū)是由trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因構(gòu)成，緊鄰trpE基因的是啟動子區(qū)（P）、操縱區(qū)（O）、前導區(qū)（L）和弱化子區(qū)（a）。色氨酸操縱子中編碼輔阻遏蛋白的基因是trpR，距色氨酸基因簇很遠 阻遏系統(tǒng)粗調(diào) ：色氨酸操縱子的效應(yīng)物是色氨酸，當培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時，它與輔阻遏蛋白結(jié)合后，結(jié)合到操縱區(qū)，阻止轉(zhuǎn)錄；當培養(yǎng)基中色氨酸供應(yīng)不足時，輔阻遏蛋白不結(jié)合色氨酸，從操縱區(qū)解離，色氨酸操縱子啟動轉(zhuǎn)錄。這種調(diào)節(jié)相當于色氨酸操縱子的粗調(diào)開關(guān) 弱化作用細調(diào) ：在前導肽的第10位和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。通過前導肽基因的翻譯來調(diào)節(jié)色氨酸操縱子轉(zhuǎn)錄的終止。因為在前導肽基因中有兩個相鄰的