【文章內(nèi)容簡介】 （3）用途 鑒定B 群鏈球菌用。?一 、碳水化合物的代謝試驗（一） 糖類發(fā)酵試驗（1）原理各種細菌含有不同的分解糖（醇、苷） 類的酶，分解糖類的能力各有不同，且不同細菌分解同一種糖的代謝產(chǎn)物也不一定相同。細菌分解糖類后形成的代謝產(chǎn)物隨細菌種類而異，有的產(chǎn)酸，有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣。可根據(jù)糖分解的特性鑒別細菌。（2）種類種類很多。常用的單糖類有：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。雙糖類有乳糖、麥芽糖、蕈糖等。多糖類有菊糖、淀粉、糊精。醇類包括甘露醇、甘油、側金盞花醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、肌醇等。（3）方法 細菌經(jīng)分離純化后， 根據(jù)待檢菌的分解特性選擇合適的含糖培養(yǎng)基，將純種細菌接種該培養(yǎng)基中， 置溫箱內(nèi)培養(yǎng)數(shù)1824小時，取出觀察結果。（4）結果能分解糖產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中指示劑是否呈現(xiàn)酸性反應。不能分解該糖則無顏色變化。產(chǎn)氣可使半固體培養(yǎng)基內(nèi)或液體培養(yǎng)基中的倒置小管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基則出現(xiàn)裂痕。（5）應用糖分解試驗是細菌生化試驗中最常用的生化反應?？梢罁?jù)細菌分解糖的能力各異而區(qū)分和識別不同的細菌。如沙門菌能發(fā)酵葡萄糖，但不發(fā)酵乳糖，大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖和乳糖。腦膜炎球菌能分解葡萄糖和麥芽糖，而淋球菌只能分解葡萄糖，不分解麥芽糖。（二） 氧化－發(fā)酵試驗（OF 試驗）（1）原理細菌在分解糖的過程中，根據(jù)有無分子氧參加，分為氧化型和發(fā)酵型。能在無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖，稱為氧化型?？蛇M行無氧降解的，稱發(fā)酵型。發(fā)酵型細菌在有氧和無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。兼性厭氧菌為發(fā)酵型細菌。不分解葡萄糖的細菌稱產(chǎn)堿型。（2）方法取2支HL(HughLeifson)培養(yǎng)管,用接種針挑取少許純培養(yǎng)細菌，穿刺接種至兩支培養(yǎng)基的管底，將其中1 支在接種后加無菌液體石蠟或者凡士林在培養(yǎng)基表面，高度約1cm 。然后將兩支培養(yǎng)管置35 ℃孵育48 小時后觀察結果。（3）結果培養(yǎng)基由綠色變黃表示細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，顏色不變表示不分解葡萄糖。兩管培養(yǎng)基均變黃色為發(fā)酵型，若加液體石蠟的一管顏色不變而另一管變黃色為氧化型，兩管均不變色為產(chǎn)堿型。（4）應用O F 試驗可區(qū)分細菌的代謝類型， 有助于鑒別區(qū)分細菌。如腸桿菌科細菌都是發(fā)酵型細菌，絕大多數(shù)的非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型細菌。葡萄球菌為發(fā)酵型而微球菌為氧化型。（三） 七葉苷水解試驗（1）原理七葉苷經(jīng)細菌水解生成七葉素，七葉素能與培養(yǎng)基中構櫞酸鐵的二價鐵離子結合生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基變黑。（2）方法 將細菌接種于七葉苷培養(yǎng)基上，在35 ℃孵育過夜。（3）結果 細菌生長并使培養(yǎng)基變黑為陽性。（4）應用 主要用于區(qū)分腸球菌、D群鏈球菌和其他鏈球菌，前兩者陽性。也可用于革蘭氏陰性桿菌和厭氧菌的鑒別試驗。（四） 淀粉水解試驗（1）原理細菌產(chǎn)生淀粉酶可將培養(yǎng)基周圍瓊脂中的淀粉水解。加碘液后，菌落周圍形成無色透明區(qū)。而瓊脂中沒分解的淀粉與碘作用產(chǎn)生藍色。試劑可用盧戈碘液或革蘭染液中的碘液。（2）方法將細菌劃線接種或點種在淀粉血清瓊脂平板或水解酪蛋白瓊脂（M －H 瓊脂）平板，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)過夜，在菌落上滴加碘液。（3）結果菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)，而其他部位培養(yǎng)基呈藍色為陽性。（4）應用某些細菌如白喉桿菌具有淀粉酶，本試驗呈陽性，可用此試驗鑒別細菌。（五）β半乳糖苷酶試驗（1）原理某些細菌具有β半乳糖苷酶，該酶可分解鄰－ 硝基苯－β－D － 半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰硝基酚。（2）方法用接種環(huán)在三糖鐵培養(yǎng)基上刮取一環(huán)新鮮菌齡的菌苔， ml 中制成濃菌懸液，加入甲苯1滴，充分振搖， 將試管置于37 ℃ 水浴中5分鐘， 加入ONPG ml ，在37 ℃水浴中保溫，于20分鐘、4小時、18小時和24小時觀察結果。（3）結果出現(xiàn)黃色為陽性反應，不變色為陰性反應。通常在20 ～30 分鐘內(nèi)顯色。（4）應用此試驗是測定不發(fā)酵或遲發(fā)酵乳糖的細菌是否產(chǎn)生半乳糖苷酶。由于細菌分解乳糖要有兩種酶，一是半乳糖昔滲透酶，另一是半乳糖苷酶。當缺乏滲透酶時，乳糖不能進入細胞，乳糖分解就不能進行。這兩種酶都是在乳糖存在的條件下誘導細菌產(chǎn)生。迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG 為陽性，如埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬。不發(fā)酵乳糖的細菌為陰性，如沙門菌屬、變形桿菌屬?？捎帽驹囼炞鳛檫t緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定方法。（六） 甲基紅試驗（1）原理細菌在糖代謝過程中,能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步將丙酮酸代謝為乳酸、乙酸、甲酸等,使培養(yǎng)基的p H ，加入甲基紅指示劑即顯紅色。某些細菌雖能分解葡萄糖，但產(chǎn)酸量少，培養(yǎng)基酸堿度在pH 以上，加入甲基紅指示劑呈黃色。甲基紅變色范圍為pH ～。（2）方法將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置35 ℃培養(yǎng)2～4天。2天后取出部分菌液滴加2滴試劑，若為陰性結果，繼續(xù)培養(yǎng)至4天再試。（3）結果紅色為陽性，橘紅色為弱陽性,黃色為陰性。（4）應用可鑒別腸桿菌科內(nèi)各菌屬。沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、埃希菌屬為陽性，腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性。較常用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的區(qū)別，前者陽性，后者陰性。（七） VP 試驗（4）原理某些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步脫羧成為乙酰甲基甲醇。后者在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙?？膳c培養(yǎng)基中精氨酸的胍基起作用，生成紅色化合物。若培養(yǎng)基內(nèi)含胍基太少，可加入少量肌酸、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反應。（2）培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。（3）試劑 ：氫氧化鉀40g 溶于水10 ml ，加肌酸0．3g 。：甲液：6 ％α萘酚乙醇溶液。乙液：40 ％氫氧化鉀。（4）方法a. 奧梅拉法：將細菌接種在上述培養(yǎng)基內(nèi)，置35℃ 培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)液2 ml ml ，置50℃水浴中2小時或37 ℃4小時，充分振搖，觀察結果。b. 貝立脫法：接種及溫育同上。在培養(yǎng)液2 ml 中加入貝立脫試劑甲液1 ml ml ，混合后置37℃中30分鐘觀察結果。如為陰性應繼續(xù)置37℃4小時再觀察。（5）結果 呈紅色為陽性。（6）應用常與甲基紅試驗一起使用。可區(qū)別腸桿菌科細菌。本試驗陽性， 甲基紅試驗陰性，反之亦然。大腸埃希菌VP陰性而產(chǎn)氣腸桿菌陽性。注：試劑甲液在室溫陰暗處可保存1 個月，乙液可長期保存。（八） 甘油復紅試驗（1）原理細菌分解甘油產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧而為乙醛，乙醛與無色的復紅生成醌式化合物，顯紫紅色。（2）方法將細菌接種于甘油復紅肉湯培養(yǎng)基，在35 ℃培養(yǎng)8天， 每天觀察結果。將未接種的培養(yǎng)基在35℃培養(yǎng)，作為對照。（3）結果紫色為陽性（＋＋），紫紅色為陽性（＋），與對照管顏色相同為陰性。（4）應用 主要用于沙門菌屬菌種間的鑒別。二 、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗（一） 吲哚（靛基質(zhì)） 試驗（1）原理有些具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可與對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。（2）試劑柯凡克（Kovac）試劑：對二甲基氨基苯甲醛5g ，戊醇75 ml ，濃鹽酸50 ml 。將對二甲基氨基苯甲醛加入乙醇內(nèi)， 振搖使溶， 徐徐加入濃鹽酸， 邊加邊搖即成。歐氏（Ehrlich） 試劑：對二甲基氨基苯甲醛4g ，95 ％乙醇380 ml ，濃鹽酸80 ％ml 。配法與柯凡克試劑相同。（3）方法將細菌接種于蛋白陳水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)1 ～2 天， ml ，試劑浮于培養(yǎng)基之上，使成兩層，即刻觀察結果。（4）結果兩液面交界處呈現(xiàn)紅色為陽性，無紅色為陰性。（5）應用主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。注：有些細菌產(chǎn)生吲哚量少，需用乙醚或二甲苯提取后才能與試劑起反應。如黃桿菌。（二） 硫化氫試驗（1）原理某些細菌分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸） 生成硫化氫，硫化氫遇鉛或鐵離子形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。（2）方法將細菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基或克氏鐵、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24～48小時，但惟赫夫尼亞菌需培養(yǎng)7天。每天觀察顏色變化。（3）結果醋酸鉛培養(yǎng)基變黑色為陽性，不變色為陰性。KI 或TSI 瓊脂在底層和斜面交界處出現(xiàn)黑色沉淀為陽性。（3）應用主要用于腸桿菌鑒別。沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬硫化氫試驗陽性，但沙門菌屬中也有部分菌為陰性。此外，腐敗謝爾瓦菌是非發(fā)酵菌中唯一能產(chǎn)生硫化氫的細菌。（三） 尿素酶試驗（1）原理某些菌能產(chǎn)生尿素酶，此酶能分解尿素形成氨，使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑隨之變紅色。（2）方法將細菌接種于尿素培養(yǎng)基，置35℃過夜培養(yǎng)觀察結果，陰性反應者應觀察4 天。（3）應用主要用于腸桿菌科的鑒定。其中變形桿菌、克雷伯菌、摩氏摩根菌、和結腸耶爾森菌、雷極普羅菲登斯菌為陽性。（四） 明膠液化試驗（1）原理細菌分泌的胞外蛋白水解酶，能分解明膠為氨基酸，使之失去原有的凝固力而液化。（2）方法將細菌接種于明膠培養(yǎng)基，在20℃ 培養(yǎng)7天，每天觀察結果。若室溫較高， 培養(yǎng)基自行融化時，可在冰箱內(nèi)放置30 分鐘后取出觀察結果。明膠平板法：在營養(yǎng)瓊脂中加入1 ％明膠傾注平板，可分成4 個區(qū)，每區(qū)劃線接種1種細菌，經(jīng)1 ～2 天培養(yǎng)，在培養(yǎng)基表面加氯化汞溶液（氫化汞12g ， 水80ml ，濃鹽酸16ml），在菌落周圍出現(xiàn)透明帶，表示細菌液化明膠。（3）結果明膠培養(yǎng)基半固體變成液體為陽性。明膠平板法菌落周圍出現(xiàn)透明帶為陽性。（4）應用根據(jù)細菌能否液化明膠，可有助于細菌的種、屬的鑒定。如陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、沙雷菌、銅綠假單胞菌等為陽性。（五） 苯丙氨酸脫氨酶試驗（1）原理細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基生成苯丙酮酸，與氯化鐵作用形成綠色化合物。（2）方法將待檢細菌大量接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面,在35℃培養(yǎng)過夜。滴加10％ 三氯化鐵4 ～5滴，由斜面培養(yǎng)物上方流下。立即觀察結果,延長反應時間會引起退色。（3）結果 斜面顯示綠色為陽性。（4）應用本試驗特異性較高。變形桿菌屬、摩根菌屬及普羅菲登斯菌為強陽性，其他腸桿菌科細菌大多為陰性?？捎糜谀c桿菌科細菌的鑒定。（六） 氨基酸脫羧酶試驗（1）原理細菌如具有某種氨基酸脫羧酶，能使氨基酸脫羧、產(chǎn)生胺和CO2，使培養(yǎng)基變堿，指示劑變色。（2）培養(yǎng)基最常用的有3 種：賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基。（3）方法將細菌接種在上述含氨基酸的培養(yǎng)基及不含氨基酸的對照培養(yǎng)基中，接種后用無菌石蠟油覆蓋，高度至少5m m 。在35℃培養(yǎng)4日觀察結果。（4）結果開始階段培養(yǎng)基由于葡萄糖分解呈酸性而呈黃色，以后變?yōu)樽仙珵殛栃越Y果，若僅發(fā)酵莆萄糖顯黃色為陰性。對照管應為黃色。（5）應用本實驗可以作為腸桿菌科細菌鑒定的重要方法，對鏈球菌和弧菌科細菌鑒定也有重要作用。（七） 精氨酸雙水解試驗（1）原理某些細菌可降解精氨酸為瓜氨酸和胺，瓜氨酸可降解為鳥氨酸、氨和二氧化碳。鳥氨酸又可受脫羧酶的作用，生成腐胺和二氧化碳。氨和腐胺可使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑隨之變紅色。（2）方法將細菌穿刺接種在索恩利（Thornley）培養(yǎng)基，并封以滅菌石蠟油，在35℃培養(yǎng)1 ～4 天， 每天觀察培養(yǎng)基顏色變化。（3）結果培養(yǎng)基轉為紅色為陽性。三、碳源和氮源利用試驗（一） 枸櫞酸鹽利用試驗（1）原理當細菌利用銨鹽作為惟一氮源，并利用枸櫞酸作為惟一碳源時，便可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鈉，生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基呈堿性。（2）方法將細菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，在35℃培養(yǎng)1～4天，每天觀察培養(yǎng)基顏色變化。（3）結果西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細菌生長，且培養(yǎng)基變藍色為陽性；培養(yǎng)7天無細菌生長，培養(yǎng)基顏色不變保持綠色為陰性?？率翔蹤此崤囵B(yǎng)基斜面變紅色為陽性，保持淡黃色不變色為陰性。（4）應用常用于腸桿菌科細菌各菌屬之間鑒別。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬、耶爾森菌屬為陰性，枸櫞酸桿菌、沙門菌、克雷伯菌屬、沙雷菌為陽性。此外，也有助于假單胞菌、氣單胞菌的鑒定。（二） 丙二酸鹽利用試驗（1）原理細菌能利用丙二酸鹽作為惟一碳源時，則能分解丙二酸鈉生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。（2）方法將細菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)過夜后觀察結果。（3）結果培養(yǎng)基由綠色變成藍色為陽性，無顏色改變是陰性。（4）應用本試驗有助于鑒別腸桿菌科細菌?？死撞鷮俸蛠喞Ｄ蔷鸀殛栃?，腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反應，其他菌屬為陰性。（三） 馬尿酸鈉水解試驗（三氯化鐵法）（1）原理某些細菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸鈉水解，產(chǎn)生苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結合，形成苯甲酸鐵沉淀。（2）方法將細菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中，置35℃ 培養(yǎng)48小時后，離心沉淀， ， ，立即混勻，經(jīng)10 ～15 分鐘觀察結果。（3）結果出現(xiàn)恒定的沉淀物為陽性，若有沉淀物出現(xiàn)，輕搖后就消失為陰性。（4）應用B群鏈球菌能分解馬尿酸鹽，呈陽性反應，其他鏈球菌為陰性。（四） 馬尿酸鈉水解試驗（茚三酮法）（1）原理細菌水解馬尿酸鈉后形成的甘氨酸，在強氧化劑茚三酮的作用下， 氧化脫氨基， 生成氨、二氧化碳和醛，茚三酮則生成了還原型茚三酮。氨、二氧化碳與殘留的茚三酮起反應，形成紫色化合物。（2）方法 ml和等量的1％馬尿酸鈉溶液混合后， 于35℃ 培養(yǎng)2小時，加入0．2 ml茚三酮試劑混勻，出現(xiàn)紫色為陽性。（4）應用B群鏈球菌能分解馬尿酸鹽，呈陽性反應，其他鏈球菌為陰性。四、細菌酶類試驗（一） 觸酶（過氧化氫酶） 試驗（1）原理細菌的呼吸酶使細菌在代謝過程中形成過氧化氫，若細菌同時產(chǎn)生觸酶，則可把過氧化氫分解為水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。（2）方法挑取純培養(yǎng)菌落1接種環(huán)，置于潔凈的