elisa常見問題和處理(編輯修改稿)
2025-04-20 04:51 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改變說明書操作，使用自己喜歡的溫育時間和溫育溫度，這樣造成一些不必要的麻煩。因為，不同試劑盒有不同的溫育時間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時間或者溫育溫度將導致試驗結(jié)果出現(xiàn)偏差。 6．洗板 固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。洗板對于ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結(jié)果。 7．邊緣效應 使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應”，并且可提高測定的重復性。 8．顯色 顯色一定要控制時間,根據(jù)試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結(jié)果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。 9．比色 比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。 其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。 綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現(xiàn)問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結(jié)于下表。 1 問：請問對同樣培養(yǎng)的相同濃度的細胞，用ELISA檢測其上清液相同細胞因子的濃度，不同的報道差別為什么很大？參考解析：不同廠家的試劑盒當然有很大影響。ELISA非常敏感，即使是同一個試劑盒，用同一個廠家同一濃度的刺激因子，incubate 時間不同也會影響結(jié)果，這就是為什么每次都要設內(nèi)部和外部對照的原因。這主要和其抗體標準品原料來源有關，建議購買ELISA試劑盒時選擇大公司提供的產(chǎn)品，這樣結(jié)果比較可靠一點。 2 問：ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育？參考解析：溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度3 問：檢測疫苗免疫小鼠后的抗體情況。用了商品化的試劑盒。 1 商品化的板子已經(jīng)用病毒裂解液包被了。 2 洗3次后，將陽性和陰性血清（豬），樣品血清（小鼠）1：40稀釋加入，留2個空做空白對照，30分鐘37度 3 洗3次，在一個空白空中加入山羊抗小鼠二抗（1:1000），一個加入商品化已稀釋抗豬二抗（不知稀釋倍數(shù)）。在陽和陰中加入抗豬二抗，樣品中加入抗鼠二抗。 4 洗4次。經(jīng)加入底物AB侯顯色15分鐘。終止。測630nm；，% ： 請問為什么兩個空白空的值差那么多？是不是鼠二抗與包被的病毒抗原結(jié)合，還是二抗
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